動態光散射法（DLS）檢測 LNP 粒度儀的影響因素研究
 

實驗材料：LNP 包裹試劑盒、檸檬酸鹽緩沖液、PBS 緩沖液

50mmol/L pH4.0 mRNA 包載檸檬酸鹽緩沖液，用于 mRNA-LNP 包封

LNP 包裹試劑盒（DLIN-MC3 型 10mmol/L）

概述

本實驗通過對相同制備條件取得的樣品進行稀釋震蕩等方式處理后測量粒徑，從而得出樣品濃度和氣泡可以影響 LNP 粒徑。

實驗目的

檢測制備得到的脂質納米顆粒的粒徑會受哪些外部條件影響

實驗背景

微流控（Microfluidic）技術是一種基于（微）流體力學理論，在管線中實現樣品制備與加工的技術。將微流體的理化模型與流體力學理論相結合，可實現樣品的混合、乳化及分離純化等功能。

粒子的布朗運動（Brownian motion）導致光強的波動，布朗運動的速度依賴于粒子的大小和媒體粘度：粒子越小、媒體粘度越小，布朗運動越快。

光通過膠體時，粒子會將光散射，在一定角度下可以檢測到光信號。

大顆粒運動緩慢，小粒子運動快速。如果測量大顆粒，那么由于它們運動緩慢，散射光斑的強度也將緩慢波動。類似地，如果測量小粒子，那么由于它們運動快速，散射光斑的密度也將快速波動。

最后通過光強波動變化和光強相關函數計算出粒徑及其分布。

實驗儀器

1. LNP 微流控制備儀

2. NEXSTAR C4 芯片

3. 納米粒度儀

微流控制備儀 nexstar nano2

不銹鋼微流控芯片，不限使用次數
 

制備脂質納米粒。本次實驗未加入 mRNA,采取空包。包裹 mRNA后粒徑會變大 6-10nm，PDI 會減小。

1. 用注射器分別吸取體積為 0.5ml 的 LNP 包裹試劑盒與體積為 1.5ml的檸檬酸鹽緩沖液，并將注射器安裝到微流控制備儀上；

2. 操作設備以 3ml/min 和 9ml/min 的流速，將注射器內的樣品注射到微流控芯片內部，制備得到需要的脂質納米粒；

3. 按照 1:1 的體積比將制備取得的成品與 PBS 緩沖液混合，獲得稀釋倍數為 2 倍的樣品；
4. 重復步驟 1-2，得到 4 組相同制備過程的樣品，分別按照不稀釋、稀釋 2 倍、稀釋 4 倍、稀釋 2 倍后劇烈搖震的方式處理；

5. 將處理好的樣品送入納米粒度儀檢測粒徑。

實驗結果

 

1.使用 PBS 緩沖液稀釋樣品可以顯著降低粒度儀所測得的樣品的粒徑。

樣品濃度過高脂質納米粒可能會發生團聚現象導致測量得到的粒徑偏大，溶液的粘度不同也會影響粒徑測量的結果，所以稀釋后測量粒徑顯著降低；

2.通過劇烈搖震在樣品內部混入氣泡后，粒度儀所測得的樣品粒徑發生顯著改變。

總結

通過稀釋可以使樣品的團聚現象改善，粒徑會趨近真實。但不建議稀釋太多，一般 4-6 倍即可，過度稀釋會導致基線噪音過大，影響結果。

可用離心或者真空來排氣泡，消除氣泡對粒徑的影響。

附錄

圖一 未稀釋


圖二 稀釋 2 倍


圖三 稀釋 4 倍


圖四 稀釋 2 倍、劇烈搖震