近日，川北醫(yī)學院藥學院化學教研室、川北醫(yī)學院口腔科&川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院口腔科、川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科和川北醫(yī)學院基礎與法醫(yī)學學院免疫學系等團隊的研究成果Positive space acquiring asymmetric membranes for guiding alveolar bone regeneration under infectious conditions（在感染條件下引導牙槽骨再生的非對稱膜的正空間獲取）在學術期刊Biomaterials Advances（原名Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications，影響因子8.457）發(fā)表。平生公司的小動物PET/CT（型號Super Nova） 產(chǎn)品在論文中提供了重要的牙槽骨CT圖像和定量分析，把單CT系統(tǒng)的功能發(fā)揮出來，實現(xiàn)了一機兩用。

該研究的第一作者為王冰博士。

文獻摘要

為了獲得適合在感染條件下引導牙槽骨再生的多功能材料，作者制備了不對稱膜，包括包含成纖維細胞抑制劑聚(p-對氧環(huán)己酮- l -苯丙氨酸)(PDPA)的空間獲取層，在兩層之間形成屏障的隔離致密層和包含羥基磷灰石或羥基磷灰石&米諾環(huán)素的誘導成骨的靜電紡絲層。然后分析了不對稱膜的組成、結晶、形貌和親水性。米諾環(huán)素結合膜控制牙齦卟啉單胞菌(P. gingivalis)體外擴增。羥基磷灰石摻入的非對稱膜促進體外MC3T3-E1細胞成骨相關基因RUNX2、OPN、ALP的表達。羥基磷灰石不對稱膜培養(yǎng)的MC3T3-E1細胞在體外也能促進礦化。不對稱膜特別是羥基磷灰石結合膜在體內(nèi)指導下頜骨缺損的再生。在感染條件下引導的骨再生在牙齦假單胞菌感染的牙槽骨缺損模型中進行評估。具體而言，含不對稱膜的空間獲取層有效控制缺損部位結締組織增生。應用單間隙獲取層膜獲得良好的引導骨再生，進一步表明積極獲取間隙對誘導骨再生的重要性。羥基磷灰石-米諾環(huán)素聯(lián)合對稱膜可同時抑制感染引起的牙槽骨重吸收，引導缺損再生。因此，羥基磷灰石-米諾環(huán)素結合的非對稱膜可能更適合用于指導復雜感染條件下骨缺損的再生。

實驗方法

不對稱膜的體內(nèi)成骨誘導作用

雄性SD大鼠24只，分為對照組、M-HA-AsM組、HA-AsM組和AsM組。戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定頭部后用碘伏消毒。隨機選取下頜骨的一側，切開皮膚和肌層，露出這一側的下頜骨表面。使用牙科環(huán)鉆在下頜骨產(chǎn)生一個滲透性骨缺損(⌀3mm)，并直接解剖缺損部位肌肉組織。然后，將膜(⌀5mm)放置在骨缺損兩側，面向下頜骨表面形成成骨誘導層。對照組在缺損部位注射0.2 mL生理鹽水，不植入任何膜。最后，在下頜缺損產(chǎn)生后立即將肌肉和皮膚逐層縫合。然后，在術后0、2、4、6或8周，對小動物使用正電子發(fā)射斷層掃描-計算機斷層掃描(PET-CT)(單CT模式，平生醫(yī)療科技昆山有限公司)監(jiān)測大鼠骨缺損再生。測定覆蓋骨缺損的骨缺損直徑和骨體積與總組織體積(3mm × 3mm × 3mm)的比值(BV/TV)。術后8周處死大鼠，取下頜骨缺損部位及周圍軟組織，用4%多聚甲醛固定。固定標本用乙二胺四乙酸(EDTA;10%)脫鈣和石蠟包埋。采集的組織切片，用HE和馬松三色染色。

不對稱膜在體內(nèi)感染條件下引導牙槽骨缺損再生的作用

雄性SD大鼠30只，分為對照組和4個膜植入組。然后用戊巴比妥鈉麻醉大鼠，固定鼠頭并用碘伏消毒。將大鼠上頜第一磨牙周圍的腭瓣切開并折疊。隨機選取下頜骨一側，用牙環(huán)鉆取出腭側牙槽骨(長2 mm ×寬2 mm ×深1 mm)。在鉆孔過程中，使用低溫鹽水(0.9%)沖洗手術表面，以降低鉆孔時牙槽骨的溫度。清創(chuàng)術后，將靜電紡絲膜放置于牙槽骨上方。下頜骨另一側缺損注射生理鹽水(0.2 mL)作為對照。然后使用可生物降解的材料閉合牙齦瓣，將牙齦P. gingivalis懸浮液(10 μL;1 × 107 CFU mL−1)注射到缺陷部位。每組一半大鼠在術后0、2、4、6、8周使用PET-CT掃描(單CT模式，平生醫(yī)療科技有限公司)監(jiān)測小動物感染誘導骨吸收和牙槽骨缺損再生的進展。確定牙槽骨缺損體積和周圍軟組織狀況。8周后對大鼠實施安樂死，取牙槽骨(包括第一磨牙及周圍軟組織)，用多聚甲醛固定(4%)，EDTA脫鈣(10%)，石蠟包埋。采集的組織切片，用HE和馬松三色染色。

實驗結果

在體內(nèi)評價M-HA-AsM、HA-AsM和AsM組對引導大鼠下頜骨缺損再生的影響，進一步驗證膜的成骨誘導作用。由于PDPA-M膜的體外成骨效果最差，且對下頜骨缺損的結締組織壓力可以忽略不計，因此未使用PDPA-M膜進行體內(nèi)成骨誘導實驗。如圖4所示，對照組BV/TV和最大骨缺損直徑均隨術后時間的延長而緩慢升高和降低。相比之下，膜處理組BV/TV和最大骨缺損直徑的增加和減少均快于對照組。換句話說，M-HA-AsM、HA-AsM和AsM組在不同程度上加速了骨缺損再生。在M-HA-AsM、HA-AsM和AsM組中，M-HA-AsM和HA-AsM誘導骨再生的效果優(yōu)于AsM，這與體外成骨誘導實驗結果一致。電紡成骨誘導層的多孔形態(tài)為成骨細胞和其他成骨相關細胞的粘附和爬行提供了支架。這促進了骨生成。因此，三種不對稱膜均促進骨缺損再生。與AsM組相比，M-HA-AsM組，尤其是HA-AsM組缺陷部位BV/TV值明顯升高，這可能與其中HA成分誘導成骨和導骨有關。M-HA-AsM誘導成骨的效果略弱于HA-AsM的原因可能是M-HA-AsM中的抗生素(米諾環(huán)素)略微抑制了成骨相關的細胞擴張，如圖3a所示。

因此，為了進一步研究缺損部位的骨再生情況，作者在缺損部位進行了病理相關實驗，結果如圖5所示。顯然，M-HA-AsM組和HA-AsM處理組再生骨增厚范圍更廣，這與圖4所示CT掃描圖像一致。

圖4。(a)不同膜處理大鼠下頜骨缺損的CT掃描圖像和三維重建。(b)下頜骨缺損最大直徑隨術后時間的變化(*表示與對照組比較P < 0.05)。(c)測量下頜骨缺損部位的BV/TV，并繪制成術后時間的函數(shù)圖(*表示與對照組相比P < 0.05)

圖6a為不同膜處理的牙槽骨缺損CT掃描重建的三維圖像。圖6b為術后8周三個方向的二維CT圖像。圖6c為CT掃描重建三維圖像所得牙槽骨缺損體積的統(tǒng)計分析結果。圖6d為術后8周CT掃描重建的軟組織3D圖像。除M-HA-AsM治療組外，其余各組大鼠術后2周內(nèi)牙槽骨重吸收明顯，如圖6a和c所示。這一結果表明，對照組和HA-AsM、AsM、PDPA-M治療組大鼠牙周炎在2周內(nèi)進展迅速。因此，M-HA-AsM組通過聯(lián)合抗生素米諾環(huán)素有效阻斷牙周炎的形成和發(fā)展。

此外，圖6b所示的結果顯示，在術后8周，對照組和AsM治療組大鼠牙根間隙存在廣泛的骨再吸收，但M-HA-AsM、HA-AsM和PDPA-M治療組大鼠牙根間隙或牙根未觀察到明顯的牙槽骨再吸收。這表明對照組和AsM治療組牙周炎進展和感染誘導的骨重吸收在8周后仍未修復。

除AsM治療組大鼠外，其余實驗組大鼠均出現(xiàn)牙槽骨缺損體積開始增加的現(xiàn)象兩周后略有恢復。提示急性細菌感染期后骨缺損已恢復。經(jīng)膜處理的大鼠恢復情況均優(yōu)于對照組。這說明所有的膜都能在一定程度上支持成骨細胞的擴散或成骨分化。HA-AsM組大鼠牙槽骨恢復最多，AsM組大鼠牙槽骨恢復最少，甚至在術后6周開始恢復。這說明M-HA-AsM、HA-AsM和PDPA-M具有較好的牙周炎抑制和骨再生誘導作用。

特別是PDPA-M組(含有一個抑制纖維化的PDPA層)能很好地引導骨再生。結締組織增生(尤其是炎癥刺激增生)嚴重損害牙齦部位牙槽骨缺損的再生，是牙周炎患者骨再生的主要障礙。為了更清晰地觀察結締組織增生，根據(jù)不同實驗部位的CT掃描重建軟組織三維圖像，如圖6d所示。顯然，對照組和AsM治療組結締組織致密增生性。雖然骨缺損沒有完全修復，但PDPA-M處理組沒有出現(xiàn)明顯的增生性結締組織，M-HA-AsM和HA-AsM處理組出現(xiàn)了一些松散的增生性結締組織。正如作者之前的研究所證明的那樣，當PDPA共聚物降解時，L-Phe(抑制成纖維細胞膨脹)被釋放出來，纖維結締組織增生可以被抑制。PDPA- M是一種可快速降解的多孔單層PDPA膜。另外三種膜均為多層復合膜，其中疏水PLGA/PLCA隔離層的加入降低了膜的親水性，減緩了PDPA層的降解。因此，纖維化抑制M-HA-AsM、HA-AsM和AsM的正向空間獲取效應均弱于PDPA-M。在M- HA-AsM組、HA-AsM組和AsM組中，AsM的親水性最差，其抑制纖維化的效果最差。

圖6所示  (a)用不同膜處理的牙槽骨缺損的CT掃描重建的3D圖像。(b)不同膜治療牙槽骨缺損術后8周CT掃描圖像。(c)牙槽骨缺損體積隨術后時間的變化(*表示與對照組比較P < 0.05)。(d)術后8周手術部位軟組織CT掃描重建3D圖像。

文獻結論

為了指導感染條件下的牙槽骨缺損再生，制備和評估了不對稱膜。米諾環(huán)素聯(lián)合M-HA-AsM體外抑制牙齦假單胞菌增殖。HA-AsM和PDPA-M支持MC3T3-E1細胞體外增殖。由于M-HA-AsM釋放二甲胺四環(huán)素，在培養(yǎng)后期對MC3T3-E1細胞有輕微的細胞毒性。由于M-HA-AsM和HA-Asm含有成骨誘導HA，在體外可促進MC3T3- E1細胞的成骨分化和礦化。這些膜，特別是M-HA-AsM和HA-AsM，在體內(nèi)指導下頜骨缺損的再生。在感染條件下，在牙齦假單胞菌感染的牙槽骨缺損模型中評估骨缺損再生指導。所有膜均引導牙槽骨缺損再生。由于其低生物相容性，AsM表現(xiàn)出最差的綜合骨修復。具體而言，M-HA-AsM、HA-AsM和PDPA- m在缺陷部位有效抑制結締組織增生，抑制纖維化，PDPA層表現(xiàn)出正空間獲取功能。利用PDPA-M獲得良好的骨再生指導，進一步表明積極獲取空間對誘導骨再生的重要性。此外，不對稱HA-AsM誘導骨再生效果最好，因為HA-AsM同時具有誘導成骨和獲得正空間的功能。在牙齦P. gingivalis感染的大鼠模型中，M-HA-AsM的牙周炎誘導骨再生能力略低于HA-AsM。盡管由于米諾環(huán)素的加入，M-HA-AsM仍然抑制了進進式牙槽骨吸收，因此可能更適合在復雜的感染條件下應用。

使用設備

                                               Super Nova^® Micro PET/CT  II代產(chǎn)品（平生醫(yī)療科技）

                                                             影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）