文獻(xiàn)信息

近日，暨南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院生命與健康工程研究院廣東省高校功能蛋白研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“腫瘤分子生物學(xué)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、首都醫(yī)科大學(xué)北京同仁醫(yī)院等單位的研究成果“In vivo genome-wide CRISPR screening identifies ZNF24 as a negative NF-κB modulator in lung cancer（體內(nèi)全基因組CRISPR篩選發(fā)現(xiàn)ZNF24在肺癌中是NF-κB的負(fù)調(diào)節(jié)因子）在雜志Cell & Bioscience（IF：9.584）上發(fā)表。平生公司的小動(dòng)物活體CT（Supernova）在論文中提供了重要的小鼠肺部腫瘤圖像。

該研究的通訊作者陳良，第一作者為劉鷺。

文獻(xiàn)摘要

腫瘤抑癌基因(tumor suppressor genes, TSGs)的系統(tǒng)鑒定及其信號(hào)通路的闡明為理解腫瘤發(fā)生提供了一個(gè)新的角度，對(duì)肺癌患者的成功治療具有重要意義。在作者目前的工作中，通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的全基因組基因敲除進(jìn)行了肺癌TSGs的體內(nèi)篩選。作者發(fā)現(xiàn)ZNF24是肺癌的有效且臨床相關(guān)的TSG。ZNF24的異位表達(dá)使肺癌細(xì)胞阻滯在S期。在機(jī)制上，ZNF24結(jié)合P65的啟動(dòng)子區(qū)域，負(fù)調(diào)控其轉(zhuǎn)錄，從而負(fù)調(diào)控NF-κB的信號(hào)通路活性。這種信號(hào)級(jí)聯(lián)與臨床相關(guān)。重要的是，作者發(fā)現(xiàn)KRAS、NF-κB和PD-1的三者聯(lián)合抑制有效地減少了轉(zhuǎn)基因小鼠模型中KrasG12D/ZNF24−/−肺癌的發(fā)生。作者目前的工作揭示了ZNF24功能缺失在肺腫瘤發(fā)生中的重要作用，為部分肺癌患者的精準(zhǔn)醫(yī)療提供了新的思路。

實(shí)驗(yàn)方法

所有小鼠均在暨南大學(xué)指定的無(wú)病原體環(huán)境中飼養(yǎng)，所有實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)暨南大學(xué)批準(zhǔn)。所有動(dòng)物工作都按照批準(zhǔn)的規(guī)程進(jìn)行。在單劑量病毒輸注實(shí)驗(yàn)中，將雙轉(zhuǎn)基因小鼠的隨機(jī)分為兩組(每組3-4只)。Teton-KrasG12D/ CC10rtTA(指定KC)雙轉(zhuǎn)基因小鼠用含Dox的飼料喂養(yǎng)2個(gè)月誘導(dǎo)肺腺癌。過(guò)表達(dá)ZNF24的逆轉(zhuǎn)錄病毒(KC-Z)或?qū)φ?KC-C)通過(guò)鼻孔吸入肺部。小鼠恢復(fù)1周后飼喂含Dox的飼料，直至處死。用蘇木精伊紅染色肺組織。采用小動(dòng)物活體CT (中國(guó)，平生醫(yī)療科技有限公司)對(duì)腫瘤負(fù)荷進(jìn)行量化。

6-8周齡Lsl- KrasG12D小鼠經(jīng)鼻吸入共表達(dá)Cre和CRISPR/Cas9的重組慢病毒。在感染6個(gè)月后，通過(guò)CT監(jiān)測(cè)ZNF24敲除小鼠(K-sgZNF24小鼠)和Td-Tomato敲除小鼠(K-sgTD小鼠為對(duì)照)的T負(fù)荷。

將靶向ZNF24的sgRNA克隆到pSECC質(zhì)粒中。在用于制備重組病毒之前，對(duì)合成質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。這些病毒通過(guò)鼻孔滴入到Lsl-KrasG12D小鼠體內(nèi)。肺癌誘導(dǎo)后6個(gè)月，通過(guò)計(jì)算機(jī)斷層掃描(Supernova CT，平生醫(yī)療科技有限公司)記錄肺負(fù)荷。用NF-κB抑制劑BAY11-7082 (selleckchem, 20 mg/kg/day)、BI3406 (selleckem, 25 mg/kg/day)和抗PD-1 (BioXcell, BP0033-2, 5 mg/kg)處理小鼠。采用CT監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

作者發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)ZNF24顯著抑制肺癌的形成(圖I, J)。檢查蘇木精和伊紅(H&E)染色的肺組織切片顯示逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)ZNF24顯著抑制KC-Z肺的腫瘤形成。

圖1 ZNF24在肺癌中是一種重要的抑癌基因。I：ZNF24表達(dá)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠原位肺腫瘤形成的影響。用表達(dá)對(duì)照病毒(KC-c)或ZNF24 (KC-Z)感染Teton-KrasG12D/CC10rtTA(指定KC)小鼠，用Dox飼料喂養(yǎng)2個(gè)月。通過(guò)CT掃描和組織學(xué)切片記錄腫瘤負(fù)荷。標(biāo)尺Bar = 500 μm。K：ZNF24表達(dá)對(duì)Lsl-KrasG12D小鼠腫瘤形成的影響重組慢病毒共表達(dá)Cre和CRISPR/Cas9，經(jīng)鼻吸入感染Lsl-KrasG12D。K-sgZNF24小鼠和K-sgTD小鼠感染6個(gè)月后肺腫瘤形成的比較。通過(guò)CT掃描和組織學(xué)切片記錄腫瘤負(fù)荷。標(biāo)尺Bar = 500 μm。

然后，作者生成了一組K-sgZNF24肺癌小鼠，如圖1M所示，并使用BAY11-7082、BI3406和抗小鼠PD-1抗體治療這些小鼠2周（Fig.5G）. Micro-CT顯示肺腫瘤幾乎完全消退(圖G, H)。

圖5聯(lián)合抑制KRAS、NF-κB和PD-1可有效抑制Kras^G12D/ZNF24−/−肺癌。G: BAY11-7082、BI3406和PD-1抗體(指定BAY+BI+PD-1)聯(lián)合治療可有效縮小K-sgZNF24小鼠肺部腫瘤。用共表達(dá)的重組慢病毒Cre和CRISPR/Cas9經(jīng)鼻滴注處理Lsl-Kras^G12D小鼠。用BAY11-7082 (20 mg/kg/天，腹腔注射)、BI3406 (25 mg/kg/天，灌胃)和PD-1抗體(5 mg/kg，隔日一次，腹腔注射)治療小鼠。CT記錄腫瘤負(fù)荷。

文獻(xiàn)結(jié)論

作者的研究描述了小鼠體內(nèi)肺癌抑癌基因的全基因組篩選。結(jié)合作者的篩選結(jié)果和TCGA數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)ZNF24是一種新型的、有效的和臨床相關(guān)的肺癌TSG。ZNF24通過(guò)誘導(dǎo)S期細(xì)胞周期阻滯發(fā)揮抑癌作用。作者進(jìn)一步明確了其分子機(jī)制:ZNF24結(jié)合P65啟動(dòng)子區(qū)，抑制其轉(zhuǎn)錄;ZNF24抑制NF-κB通路信號(hào)通路活性及相關(guān)cyclin/CDKs的表達(dá)。ZNF24-P65-cyclin/ CDK軸與臨床相關(guān)。作者還發(fā)現(xiàn)很大一部分肺癌患者中ZNF24基因缺失。作者目前的工作揭示了ZNF24功能缺失在肺腫瘤發(fā)生中的重要作用，為部分肺癌患者的精準(zhǔn)治療提供了新的思路。

使用設(shè)備

Micro CT（型號(hào)：Super Nova）（平生醫(yī)療科技）

             影像軟件：Avatar（平生醫(yī)療科技）