不同細胞種類、來源、實驗要求和目的選擇不同細胞純化方法的介紹
體外培養(yǎng)細胞源于動物機體，而機體內(nèi)的細胞都混雜生長，每一種組織都有血管和間葉組織，因此，從體內(nèi)取得的培養(yǎng)材料所做的原代培養(yǎng)，絕大多數(shù)都是各種細胞混合生長。其主要表現(xiàn)為兩大類，即上皮樣細胞和纖維樣細胞。在體外培養(yǎng)的細胞中即使都是纖維樣細胞或上皮樣細胞，它們也有種類的不同，如纖維樣細胞包括成纖維細胞、肌細胞、骨細胞、滑膜細胞等。而利用體外培養(yǎng)細胞進行實驗研究都要求采用單一種類細胞，這樣才能對某一細胞的功能、形態(tài)等的變化進行研究，因此培養(yǎng)細胞的純化就成為體外培養(yǎng)細胞實驗研究的重要一步。
細胞的純化一般分為自然純化和人工純化兩大類�？筛鶕�(jù)不同細胞種類、來源、實驗要求和目的而選擇不同的純化方法。下面主要介紹一些基本的方法
一、自然純化
3. 反復貼壁法
（2）方法：將細胞懸液接種到一個培養(yǎng)瓶內(nèi)（最好用無血清培養(yǎng)，因為在無血清支持下，上皮細胞貼壁更慢）靜置 20 min；在顯微鏡下觀察，見細胞部分貼壁，稍加搖蕩也不浮起時，將培養(yǎng)液連同尚未貼壁細胞一起倒出或吸到另一培養(yǎng)瓶；繼續(xù)培養(yǎng)或重復上述操作，將上皮細胞和成纖維細胞逐步分隔開。
4. 克隆法
細胞的純化一般分為自然純化和人工純化兩大類�？筛鶕�(jù)不同細胞種類、來源、實驗要求和目的而選擇不同的純化方法。下面主要介紹一些基本的方法
一、自然純化
自然純化即利用某一種類細胞的增殖優(yōu)勢，排擠其他細胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優(yōu)勢細胞，去除其他細胞，達到細胞純化的目的。但這種方法常無法人為的選擇細胞，時間長，多數(shù)情況下，剩下的都是成纖維細胞，因此，僅有些惡性腫瘤細胞可以通過此方法，自然純化而建立細胞系。
二、人工純化
利用人為手段造成對某一細胞生長有利的環(huán)境條件，抑制其他細胞的生長，從而達到純化細胞的目的。
1. 酶消化法
①概述：由于上皮細胞和成纖維細胞對胰蛋白酶的耐受性不同，成纖維細胞對胰蛋白酶比較敏感，而上皮細胞對胰蛋白酶的耐受性較高，因此，在消化培養(yǎng)細胞時，成纖維細胞先脫壁，而上皮細胞要消化相當長的時間才脫壁，特別是原代培養(yǎng)和培養(yǎng)早期,這種差異尤為明顯，因而可以利用這種差異采用多次差別消化方法，將上皮細胞和成纖維細胞分開達到純化細胞的目的。
②方法：采用普通消化傳代方法，將 0.25%胰蛋白酶注入培養(yǎng)瓶內(nèi)兩次，每次加 1 mL（25 mL培養(yǎng)瓶），稍加搖動讓胰蛋白酶流過所有細胞表面，然后倒掉。蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)纖維樣細胞變圓，部分脫壁，立即加入 2mL 有血清培養(yǎng)液，終止消化。用彎頭吸管輕輕吹打纖維樣細胞生長的區(qū)域（可事先在顯微鏡下用記號筆在培養(yǎng)瓶上畫出記號）。吹打過程中不要用力，也不要吹上皮細胞生長區(qū)域。吹打結(jié)束后，再用少量培養(yǎng)液漂洗一遍，然后加入適量培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，也可重復上述操作再進行一次，或隔幾日后或下次傳代時，再進行上述操作。經(jīng)過幾次處理可以將成纖維細胞去除或?qū)烧叻珠_。
2. 機械劃除法
2. 機械劃除法
（1）概述：原代培養(yǎng)成功后，上皮細胞和成纖維細胞多數(shù)都同時出現(xiàn)，混雜生長。這種混雜生長常常分區(qū)呈片，每種細胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上。因此可以采用機械的方法去除不需要的細胞的區(qū)域，而保留需要的。
（2）方法：將要純化細胞的培養(yǎng)瓶，放在倒置顯微鏡監(jiān)視下進行。用彎頭滴管在不需要生長的細胞區(qū)域推劃，使細胞脫壁懸浮在培養(yǎng)液中，注意不要傷及所需細胞；推劃后用培養(yǎng)液沖洗兩次，即可加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；數(shù)日后如發(fā)現(xiàn)不需要的細胞又長出，可再進行上述操作，這樣反復多次可以純化細胞。操作過程要嚴格無菌操作，防止污染。
3. 反復貼壁法
（1）概述：成纖維細胞與上皮細胞相比，其貼壁過程快，大部分細胞常能在 10~30 min 完成附著過程（但不一定完全伸展）；而上皮細胞大部分在短時間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起。利用不同細胞貼壁速度不同的特點，經(jīng)過反復貼壁，可以將早期傳代培養(yǎng)中的成纖維細胞和上皮細胞分開。
（2）方法：將細胞懸液接種到一個培養(yǎng)瓶內(nèi)（最好用無血清培養(yǎng)，因為在無血清支持下，上皮細胞貼壁更慢）靜置 20 min；在顯微鏡下觀察，見細胞部分貼壁，稍加搖蕩也不浮起時，將培養(yǎng)液連同尚未貼壁細胞一起倒出或吸到另一培養(yǎng)瓶；繼續(xù)培養(yǎng)或重復上述操作，將上皮細胞和成纖維細胞逐步分隔開。
4. 克隆法
在同一細胞系中，存在不同的細胞株，它們的功能和生長特點僅略有不同，要純化出某一種細胞，用上述方法常不能將同一細胞系的不同株分開，可采用細胞克隆的方法。具體過程是采用細胞克隆法將細胞分成單個細胞，使之分別生長成克隆，然后對每一克隆進行測試，選擇出所需要的克隆。
5. 培養(yǎng)基限定方法
某些細胞在生長過程中必須存在或去除某種物質(zhì)，否則將無法生長，而其他細胞與之相反�？梢岳眠@種技術來純化細胞。如雜交瘤技術中常用的 HAT 培養(yǎng)液，就用來篩選雜交瘤細胞而抑制其他細胞。
6. 流式細胞儀分離法
流式細胞儀可根據(jù)細胞核酸含量、某些物質(zhì)含量或細胞結(jié)構(gòu)大小等參數(shù)來將細胞分離成不同的群體。
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細胞純化
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