摘要
α-黑色素細(xì)胞刺激激素（α-MSH）會觸發(fā)褪黑激素產(chǎn)生，這是人體應(yīng)對紫外輻射刺激的天然保護措施。皮膚暴露在紫外輻射刺激下會促進α-MSH的產(chǎn)生。因此，在身體受到紫外輻射刺激之前，先刺激褪黑激素的生物合成可預(yù)防紫外輻射誘導(dǎo)的皮膚癌癥。[1]

天然的α-MSH在體內(nèi)非常不穩(wěn)定，因此作為治療劑的α-MSH多是它的類似物。[2-4]其中MT-Ⅱ（圖1），作為α-MSH的類似物，是一種環(huán)肽，不僅對酶的降解有良好的抗性，并且具有很強的效力。

因為MT-Ⅱ的現(xiàn)實意義和大規(guī)模生產(chǎn)需求，所以我們的工作重點是優(yōu)化一種全自動的多肽合成途徑，比如多肽序列的線性合成及最終在樹脂上作肽的內(nèi)酰胺化反應(yīng)。在PurePep® Chorus多肽合成儀上，我們使用不同的肽合成策略全自動合成MT-Ⅱ，以探索最佳合成條件。然后選擇其中最優(yōu)合成方式，利用PurePep® Sonata®+多肽合成儀對MT-Ⅱ進行合成放大。
 

實驗結(jié)果
利用PurePep® Chorus多肽合成儀探索合成條件，在多次合成實驗后發(fā)現(xiàn)，直接的合成方式并不是合成MT-Ⅱ的最佳選擇，因為直接合成過程總是會產(chǎn)生大量的天冬氨酰亞胺(aspartimide)副產(chǎn)物。因此，我們采取分步合成的方式，大大降低了副產(chǎn)物的產(chǎn)生，顯著提高MT-Ⅱ粗品的純度，并且發(fā)現(xiàn)其中方法G是最優(yōu)的合成方式。

在優(yōu)化合成方法后，利用PurePep® Sonata®+中試級多肽合成儀對其進行放大合成，最終在5 mmol的規(guī)模下成功合成了MT-Ⅱ。

這項工作結(jié)合了PurePep® Chorus 和 PurePep® Sonata®+兩款多肽合成儀，并且表現(xiàn)出了強大的合成流程開發(fā)能力、穩(wěn)定的合成方法轉(zhuǎn)移放大效果。
 

結(jié)論
1 在PurePep® Chorus上實現(xiàn)MT-Ⅱ的全自動合成，包括側(cè)鏈脫保護和樹脂上環(huán)化
2 開發(fā)了合成的反應(yīng)條件（方法G），以優(yōu)化的耦合條件最大限度減少副反應(yīng)發(fā)生
3 該方法被成功轉(zhuǎn)移到PurePep® Sonata®+進行擴大規(guī)模合成，并且保持了MT-Ⅱ的高粗品純度
 

PurePep® Chorus
 

對各種方法進行比較，發(fā)現(xiàn)通過使用方法G在PurePep® Chorus多肽合成儀上合成MT-Ⅱ時天冬氨酰亞胺(aspartimide) 雜質(zhì)明顯減少。于是選擇這種方式在PurePep® Sonata®+大規(guī)模多肽合成儀上進行5 mmol MT-Ⅱ的放大合成。再次使用Rink Amide MBHA 樹脂（0.35 mmol/g），考慮到相關(guān)成本會隨著多肽合成規(guī)模的擴大而增加，于是應(yīng)用3倍的過量試劑進行合成，逐步合成分析。在此過程中發(fā)現(xiàn)D-Phe和Nle需要重復(fù)耦合以便提高偶聯(lián)效率，這種方法與原先在Chorus上的方法略有調(diào)整。合成方法的其他方面保留了一致性，并且取得了非常好的結(jié)果。

合成完成后，使用DMF和DCM將樹脂洗滌，干燥，然后利用TFA/EDT/H2O/TIS（94:2.5:2.5:1）室溫切肽1小時，乙醚沉淀。將收集的多肽溶于水/乙腈溶液中，使用Shimadzu Prominence HPLC進行收率分析，采用C18，100 Å，5 μm，100 × 4.6 mm Kinetex 色譜柱（Phenomenex），流速1 mL/min，流動相A緩沖液使用含0.1%TFA的超純水，B緩沖液使用含0.1%TFA的乙腈，用5-95%的B緩沖液進行梯度洗脫25分鐘，214 nm波長進行檢測。分子量分析采用Shimadzu LCMS-2020 Single-Quad質(zhì)譜儀進行檢測，C18，100 Å，5 μm，50 × 2.1 mm的色譜柱（Agilent），流速1 ml/min，流動相A緩沖液使用含0.1%甲酸的超純水，B緩沖液使用含0.1%甲酸的乙腈，用5-95%的B緩沖液進行梯度洗脫20分鐘。
 

PurePep® Sonata®+

參考文獻
1. V. V. Ryakhovsky, G. A. Khachiyan, N. F. Kosovova, E. F. Isamiddinova and A. S. Ivanov, Beilstein J. Org. Chem. 2008, 4, 39.

2. F. Al-Obeidi, A. M. Castrucci, M. E. Hadley, V. J. Hruby, J. Med. Chem. 1989, 32, 2555–2561.

3. F. Al-Obeidi, M. E. Hadley, B. M. Pettitt, V. J. Hruby, J. Am. Chem. Soc. 1991, 111,3413–3416.

4. A. Todorovic, J. R. Holder, R. M. Bauzo, J. W. Scott, R. Kavanagh, Z. Abdel-Malek, C. Haskell-Luevano, J. Med. Chem. 2005, 48, 9, 3328–3336.

5. D0042170 From Small to Large Scale Optimizing and upscaling the synthesis of melanotan II (MT-II) - Melanocortin Receptor Agonist, on PurePep® Chorus and PurePep® Sonata®+.

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