“道生一，一生二，二生三，三生萬物”。這是出自老子《道德經》第四十二章的一句話，它道盡了干細胞的玄妙。那什么是“生萬物之道呢”？對于干細胞來說，要做到“生萬物”，合適的誘導分化是關鍵。如21年德國杜賽爾多夫海因里希海涅大學的Jay Gopalakrishnan團隊用醋酸視黃醇誘導的眼睛類器官[1]；維也納奧地利科學院科研團隊誘導的心臟類器官[2]。而在進行誘導分化“轉化萬物”之前，干細胞的“一生二，二生三”也是不可忽視的。如何在“轉化萬物”前擴增制備足夠數量的干細胞而又不使其經受刺激“提前轉化”呢？那當然就是選擇一款性能優異、誘導干擾極低的基質膠啦！

 

本周我們對Cat.No.082777/0827775基質膠進行了ES細胞培養測評。讓我們一起看看怎么培養ES細胞以及最終效果吧！
 

一.樣本信息

模基基質膠


對照組

 

二.實驗流程

 

1.培養材料

試劑：ES細胞、MatrigengeL Matrix、10mM ROCK 抑制劑（Y-27632，工作濃度10μM）；DMEM /F12培養基；mTeSR1/E8培養基；Accutase/EDTA解離劑；PBS(D-PBS)；

材料：無菌槍頭；6 孔板；無菌EP管等耗材；可根據實驗設計自行調整。

 

2.培養預備

（1）配置基質膠混合液

a、將基質膠置冰上在4℃冰箱過夜解凍；

b、4℃預冷無菌離心管、無菌槍頭、DMEM基礎培養基等接觸基質膠的耗材或試劑；

c、將Matrigengel（Cat.No.0827775）按1:80 - 1:100的比例稀釋，對于ES細胞培養，建議涂布濃度約為0.013mg/cm²。

例如，將12.5mg/mL的Matrigengel使用冰冷的DMEM/F12，1:100稀釋后，每個6孔板的涂布量為1mL。
 

（2）制作基質膠涂層

a、按照0.013mg/cm²的量加入Matrigengel混合物加入到預冷的6孔板中，并輕輕搖動培養板以確保混合物均勻地分布在培養板上；

b、將6孔板轉移到37℃培養箱中進行過夜孵育（孵育1-2小時后即可使用，但過夜孵育的涂層更有利于細胞培養）；

c、使用前吸棄涂層上面的液體。

 

3.ES傳代

（1）傳代前準備好基質膠涂布的六孔板及含10μM Y-27632抑制劑的培養基；

（2）顯微鏡下觀察ES細胞狀態，在潔凈工作臺中吸棄舊培養基，用半培養基量的PBS沖洗后加入培養量一半體積的Acuutase（6孔板中加入0.5mL即可）；

（3）轉移到37℃培養箱消化4分鐘，或在顯微鏡下觀察直到大部分細胞脫落；如果細胞仍然附著，輕輕拍打培養板3-5次，或者在培養箱中孵育適當延長消化時間（不超過15分鐘）；

（4）傾斜培養板，將Accutase溶液沿培養層表面轉移兩次，分離結塊并轉移到離心管中；

（5）用DMEM/F12培養基沖洗培養層表面，并與管中的細胞溶液合并在一塊；

（6）室溫下300g 離心5分鐘（殘留的Accutase會干擾細胞的附著和下游應用，如果進行轉染，應該盡量去除干凈）；

（7）吸去上清，用含有10μM Y-27632抑制劑的培養基進行重懸；如果需要，可以用細胞計數器進行細胞計數并計算細胞鋪板的體積和面積；

（8）將細胞加入涂層板中，輕輕搖動使細胞分布均勻；

（9）將培養板放入37℃培養箱中培養。

 

4.結果觀察

（1）培養24h后換液，撤掉含抑制劑的培養基，換為正常培養基；

（2）換液后24h觀察并拍照記錄。

注意：MatrigengeL Matrix> 4℃時會逐漸聚合成膠，請嚴格把控操作溫度，控制操作時間，稀釋后的基質膠混合液同樣需要冰上操作；板材可以在孵育一小時后使用，但過夜孵育的涂層可以使細胞產生較好的長期形態。

 

三.實驗結果

 

10×物鏡下視野

 

4×物鏡下視野

 

四.結果分析

 

1.從細胞的克隆形成率以及克隆面積上看，用Brand C基質膠培養的ES細胞與用模基基質膠培養的效果相當。 

2.兩款基質膠均無細胞分化現象產生。

 

五.關于模基基質膠

 

模基生物基質膠經過嚴格的質檢驗證，具備安全性高、濃度多樣性、批次穩定性好、低內毒素、無污染的特點。在購買模基產品時，根據用戶個性化的需求對用戶進行最佳產品、貨號的推薦，以便用戶獲得性價比最高、效果最優的產品。

 

進行ES細胞培養時推薦使用干細胞專用金牌基質膠，干細胞專用金牌基質膠是在低生長因子基質膠之上再次進行優化并附加多項測試的基質膠，去除干擾因子，更適合干細胞的生長以及后續添加因子和抑制劑的人為誘導分化。

 

六.參考資料

[1] https://doi.org/10.1016/j.stem.2021.07.010

[2] https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.04.034