缺氧預處理間充質干細胞在共培養系統中改善人胰島存活和功能
胰島細胞移植已成為一種潛在的細胞療法，可為遇到嚴重低血糖發作的特定 1 型糖尿病患者恢復葡萄糖穩態。細胞凋亡是導致移植的胰島細胞死亡的最重要因素。胰島破壞的早期引發因素是缺氧，損害β細胞功能和存活。缺氧還通過活性氧（ROS）的過量產生誘導氧化應激，導致移植前后細胞凋亡。因此，有必要通過臨床上可行的方法來抑制細胞凋亡并提高胰島質量，以獲得更好的移植結果。
一些研究表明，間充質干細胞（MSCs）在培養期間和移植后通過分泌旁分泌因子或直接接觸細胞和細胞外基質產生對胰島的存活和功能具有支持作用。氧濃度是影響間充質干細胞的重要因素。研究表明，缺氧預處理的MSC（Hpc-MSCs）在1-7% O2在短時間內激活Akt和細胞外調節激酶（ERK）信號通路，顯著增強抗凋亡，抗氧化，促生存和促血管生成因子的產生，例如Bcl-2、VEGF、HGF、過氧化氫酶和Ho-1。移植的HPC-MSCs在肺纖維化、心肌損傷、急性腎臟、腦和肝臟損傷等多種疾病中顯示出有效的治療效果。然而，關于Hpc-MSCs與胰島細胞共培養或共移植的研究非常有限，需要更多的研究。
基于此，伊朗德黑蘭醫科大學、設拉子醫科大學科研團隊的一項研究曾探討了HPC-MSCs在直接和間接共培養體系中是否能降低應激因子，抑制線粒體凋亡通路，改善人胰島生存和功能，該研究使用了Wharton's Jelly 來源的MSC（WJ-MSCs），因為與其他來源的MSCs相比，它不表達主要的組織相容性復合體II類（MHC-II），更容易獲得，并且增殖能力更高。
HPC-MSCs和Nc-MSCs中VEGF分泌的比較
為了證實缺氧對WJ-MSCs的積極作用，實驗首先評估了在缺氧（HPC-MSCs，5% O2，5% CO2）和正常條件（Nc-MSCs，20% O2，5% CO2）下培養24小時后的血管內皮細胞生長因子（VEGF）分泌（缺氧增強的生長因子之一）。結果顯示，HPC-MSCs中的VEGF含量幾乎是Nc-MSCs的3倍。
WJ-MSCs 在培養期間增加了人類胰島的存活率
生存評估顯示，在培養期間，對照組中胰島細胞存活率約為25%，與MSCs共培養將胰島細胞存活率提高到100%。HPC-MSCs和Nc-MSCs共培養組的存活率相似，兩者之間無顯著差異（圖1）。
WJ-MSCs在培養期間抑制人胰島細胞凋亡
對照組中凋亡胰島細胞的百分比約為70%，而與WJ-MSCs共培養將胰島細胞死亡率降低至10% 以下。兩個直接共培養組的減少量比間接共培養組更顯著，但Hpc-MSCs組和Nc-MSCs組之間沒有差異（圖2）。
圖2 與HPC-MSCs和Nc-MSCs共培養的人胰島細胞的凋亡。
共培養胰島細胞中Bcl-2增加，Bax和Caspase-3 減少
在共培養胰島細胞中，抗凋亡標志物Bcl-2顯著增加，促凋亡標志物 Bax在基因表達和蛋白質水平上顯著降低。HPC-MSCs組和Nc-MSCs組之間沒有明顯差異。caspase-3 蛋白作為細胞凋亡的主要指標，在共培養胰島細胞中得到顯著降低。caspase-3 的基因表達在所有共培養組中也降低，但是在任何組中都不顯著。
直接共培養的 HPC-MSCs 組顯著提高了胰島功能
所有共培養胰島細胞的胰島素和C肽分泌均增加。直接共培養組的增量大于間接共培養組。然而，僅在直接共培養的HPC-MSCs組中觀察到顯著增加（圖3 a、b）。所有共培養組的胰島素mRNA水平均增強。在直接共培養的 Hpc 和 Nc-MSCs 組中均觀察到統計學意義（圖3 c）。
圖3 葡萄糖刺激（a）C肽和（b）胰島素分泌物以及（c）胰島素mRNA表達在與Hpc-MSCs和Nc-MSCs共培養的人胰島細胞中的表達。
HIF-1α在胰島中檢測到，在共培養組中降低
HIF-1α蛋白作為缺氧的主要標志物，在缺氧條件下均有表達，但在共培養的胰島中存在WJ-MSCs時降低。與對照組相比，胰島細胞共培養組HIF-1α mRNA表達降低，但下降不顯著。這可能與缺氧條件下HIF-1α在蛋白質穩定性水平上的調控有關。
WJ-MSCs 存在下抑制 p53 蛋白
p53蛋白被檢測為HIF-1α在長時間缺氧條件下穩定的下游靶點之一。結果顯示，p53僅存在于對照組中，并且在所有共培養胰島細胞中均受到抑制，提示WJ-MSCs對胰島細胞凋亡具有抗凋亡作用（圖4）。
WJ-MSCs 存在下 ROS 顯著降低
實驗還在離體胰島中測量與誘導細胞凋亡相關的氧化標記物ROS的產生。在培養后，還檢測了Nc-MSCs和Hpc-MSCs中單獨的ROS量，以恢復共培養組的標準化。將胰島對照組和共培養組進行比較（圖5）。ROS產量在胰島對照組中最高，而在與HPC-MSCs和Nc-MSCs間接共培養的胰島中較低。在接觸MSC的情況下，ROS的產量是所有胰島組中最低的。這可能表明間充質干細胞對分離的胰島細胞具有抗氧化作用。培養5 天后，Nc-MSCs（對照）中的ROS量低于Hpc-MSCs（對照）組，但差異不顯著。
與 Hpc-WJ-MSCs 共培養胰島細胞中的 VEGF 顯著增強
VEGF mRNA在胰島對照組中最低，而在與Hpc-MSCs和Nc-MSCs直接接觸和間接接觸共培養的胰島細胞中誘導的VEGF mRNA轉錄水平相對較高。然而，這僅在直接和間接 HPC-MSCs 共培養組中顯著觀察到（圖6 a）。
在胰島對照組和胰島共培養組中也評估了VEGF分泌。將胰島對照組和共培養組進行比較（圖6 b）。VEGF分泌在HPc-MSCs共培養組（直接和間接）中最高，在Nc-MSCs共培養組中中等，在胰島對照組中最低。有趣的是，在培養5天后，單獨Hpc-MSCs中的VEGF含量仍然高于Nc-MSCs。
鑒于胰島在1型糖尿病治療中的應用前景廣闊，因此有必要關注與胰島的最佳分離，培養期和移植相關的所有方面。綜上所述，該研究表明，Hpc-WJ-MSCs作為移植前培養的支持細胞，可以保護離體的人胰島細胞免受應激誘導的細胞凋亡，為移植成功提供可存活胰島和提升胰島功能，特別是通過直接共培養系統。
參考文獻：Keshtkar S, Kaviani M, Jabbarpour Z, Sabet Sarvestani F, Ghahremani MH, Esfandiari E, Hossein Aghdaei M, Nikeghbalian S, Shamsaeefar A, Geramizadeh B, Azarpira N. Hypoxia-Preconditioned Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells Mitigate Stress-Induced Apoptosis and Ameliorate Human Islet Survival and Function in Direct Contact Coculture System. Stem Cells Int. 2020 Dec 17;2020:8857457. doi: 10.1155/2020/8857457. PMID: 33381188; PMCID: PMC7759420.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33381188/
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一些研究表明，間充質干細胞（MSCs）在培養期間和移植后通過分泌旁分泌因子或直接接觸細胞和細胞外基質產生對胰島的存活和功能具有支持作用。氧濃度是影響間充質干細胞的重要因素。研究表明，缺氧預處理的MSC（Hpc-MSCs）在1-7% O2在短時間內激活Akt和細胞外調節激酶（ERK）信號通路，顯著增強抗凋亡，抗氧化，促生存和促血管生成因子的產生，例如Bcl-2、VEGF、HGF、過氧化氫酶和Ho-1。移植的HPC-MSCs在肺纖維化、心肌損傷、急性腎臟、腦和肝臟損傷等多種疾病中顯示出有效的治療效果。然而，關于Hpc-MSCs與胰島細胞共培養或共移植的研究非常有限，需要更多的研究。
基于此，伊朗德黑蘭醫科大學、設拉子醫科大學科研團隊的一項研究曾探討了HPC-MSCs在直接和間接共培養體系中是否能降低應激因子，抑制線粒體凋亡通路，改善人胰島生存和功能，該研究使用了Wharton's Jelly 來源的MSC（WJ-MSCs），因為與其他來源的MSCs相比，它不表達主要的組織相容性復合體II類（MHC-II），更容易獲得，并且增殖能力更高。
HPC-MSCs和Nc-MSCs中VEGF分泌的比較
為了證實缺氧對WJ-MSCs的積極作用，實驗首先評估了在缺氧（HPC-MSCs，5% O2，5% CO2）和正常條件（Nc-MSCs，20% O2，5% CO2）下培養24小時后的血管內皮細胞生長因子（VEGF）分泌（缺氧增強的生長因子之一）。結果顯示，HPC-MSCs中的VEGF含量幾乎是Nc-MSCs的3倍。
WJ-MSCs 在培養期間增加了人類胰島的存活率
生存評估顯示，在培養期間，對照組中胰島細胞存活率約為25%，與MSCs共培養將胰島細胞存活率提高到100%。HPC-MSCs和Nc-MSCs共培養組的存活率相似，兩者之間無顯著差異（圖1）。
圖1 與Hpc-MSCs和Nc-MSCs共培養的人胰島存活率。
WJ-MSCs在培養期間抑制人胰島細胞凋亡
對照組中凋亡胰島細胞的百分比約為70%，而與WJ-MSCs共培養將胰島細胞死亡率降低至10% 以下。兩個直接共培養組的減少量比間接共培養組更顯著，但Hpc-MSCs組和Nc-MSCs組之間沒有差異（圖2）。
圖2 與HPC-MSCs和Nc-MSCs共培養的人胰島細胞的凋亡。
共培養胰島細胞中Bcl-2增加，Bax和Caspase-3 減少
在共培養胰島細胞中，抗凋亡標志物Bcl-2顯著增加，促凋亡標志物 Bax在基因表達和蛋白質水平上顯著降低。HPC-MSCs組和Nc-MSCs組之間沒有明顯差異。caspase-3 蛋白作為細胞凋亡的主要指標，在共培養胰島細胞中得到顯著降低。caspase-3 的基因表達在所有共培養組中也降低，但是在任何組中都不顯著。
直接共培養的 HPC-MSCs 組顯著提高了胰島功能
所有共培養胰島細胞的胰島素和C肽分泌均增加。直接共培養組的增量大于間接共培養組。然而，僅在直接共培養的HPC-MSCs組中觀察到顯著增加（圖3 a、b）。所有共培養組的胰島素mRNA水平均增強。在直接共培養的 Hpc 和 Nc-MSCs 組中均觀察到統計學意義（圖3 c）。
HIF-1α在胰島中檢測到，在共培養組中降低
HIF-1α蛋白作為缺氧的主要標志物，在缺氧條件下均有表達，但在共培養的胰島中存在WJ-MSCs時降低。與對照組相比，胰島細胞共培養組HIF-1α mRNA表達降低，但下降不顯著。這可能與缺氧條件下HIF-1α在蛋白質穩定性水平上的調控有關。
WJ-MSCs 存在下抑制 p53 蛋白
p53蛋白被檢測為HIF-1α在長時間缺氧條件下穩定的下游靶點之一。結果顯示，p53僅存在于對照組中，并且在所有共培養胰島細胞中均受到抑制，提示WJ-MSCs對胰島細胞凋亡具有抗凋亡作用（圖4）。
圖4 與 Hpc-MSCs 和 Nc-MSCs 共培養的人胰島中的 p53 蛋白水平。
WJ-MSCs 存在下 ROS 顯著降低
實驗還在離體胰島中測量與誘導細胞凋亡相關的氧化標記物ROS的產生。在培養后，還檢測了Nc-MSCs和Hpc-MSCs中單獨的ROS量，以恢復共培養組的標準化。將胰島對照組和共培養組進行比較（圖5）。ROS產量在胰島對照組中最高，而在與HPC-MSCs和Nc-MSCs間接共培養的胰島中較低。在接觸MSC的情況下，ROS的產量是所有胰島組中最低的。這可能表明間充質干細胞對分離的胰島細胞具有抗氧化作用。培養5 天后，Nc-MSCs（對照）中的ROS量低于Hpc-MSCs（對照）組，但差異不顯著。
圖5 與 Hpc-MSCs 和 Nc-MSCs 共培養的人類胰島細胞中的 ROS 產生。
與 Hpc-WJ-MSCs 共培養胰島細胞中的 VEGF 顯著增強
VEGF mRNA在胰島對照組中最低，而在與Hpc-MSCs和Nc-MSCs直接接觸和間接接觸共培養的胰島細胞中誘導的VEGF mRNA轉錄水平相對較高。然而，這僅在直接和間接 HPC-MSCs 共培養組中顯著觀察到（圖6 a）。
在胰島對照組和胰島共培養組中也評估了VEGF分泌。將胰島對照組和共培養組進行比較（圖6 b）。VEGF分泌在HPc-MSCs共培養組（直接和間接）中最高，在Nc-MSCs共培養組中中等，在胰島對照組中最低。有趣的是，在培養5天后，單獨Hpc-MSCs中的VEGF含量仍然高于Nc-MSCs。
圖6 與Hpc-MSCs和Nc-MSCs共培養的人胰島中的VEGF分泌和mRNA表達。
鑒于胰島在1型糖尿病治療中的應用前景廣闊，因此有必要關注與胰島的最佳分離，培養期和移植相關的所有方面。綜上所述，該研究表明，Hpc-WJ-MSCs作為移植前培養的支持細胞，可以保護離體的人胰島細胞免受應激誘導的細胞凋亡，為移植成功提供可存活胰島和提升胰島功能，特別是通過直接共培養系統。
參考文獻：Keshtkar S, Kaviani M, Jabbarpour Z, Sabet Sarvestani F, Ghahremani MH, Esfandiari E, Hossein Aghdaei M, Nikeghbalian S, Shamsaeefar A, Geramizadeh B, Azarpira N. Hypoxia-Preconditioned Wharton's Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells Mitigate Stress-Induced Apoptosis and Ameliorate Human Islet Survival and Function in Direct Contact Coculture System. Stem Cells Int. 2020 Dec 17;2020:8857457. doi: 10.1155/2020/8857457. PMID: 33381188; PMCID: PMC7759420.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33381188/
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