李毓龍實驗室可遺傳編碼神經遞質熒光探針領域近五年研究成果文獻集錦
帶你看文獻，只做純干貨
文獻精讀第49期
北京大學生命科學學院李毓龍教授實驗室近年來致力于系統性地發展神經化學分子的檢測技術，先后開發了針對膽堿類、單胺類、嘌呤類和脂類神經遞質或神經調質的熒光探針，以幫助研究人員實時、定量地研究神經遞質的釋放在生理以及病理情形下的重要作用，為領域內提供了一系列劃時代的新型有力工具。在此，本文對李毓龍教授實驗室在可遺傳編碼熒光探針領域近五年的研究成果進行了回顧。
01 乙酰膽堿乙酰膽堿（Acetylcholine, ACh）作為第一種被鑒定出來的神經遞質，是神經元之間信息溝通的關鍵媒介分子，與肌肉收縮、學習記憶、注意等相關。目前研究人員對于乙酰膽堿在中樞神經系統中的作用仍然存在較大爭議。由于神經系統的復雜性以及乙酰膽堿的功能多樣性，精確監測體內乙酰膽堿信號的動態變化，能夠幫助研究人員更好地理解乙酰膽堿的生理學以及病理學意義。2018年7月9日，李毓龍實驗室與弗吉尼亞大學醫學院合作，在Nature Biotechnology期刊上發表了題為“A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies”的研究論文。該研究首次成功地開發了具有高靈敏度、高特異性、可遺傳編碼的第一代乙酰膽堿熒光探針（GACh）。該探針基于環化重排熒光蛋白（cpGFP）對結構變化敏感的特性，將神經遞質激活后的受體構象變化轉變為熒光蛋白的熒光信號變化，從而實時精確地監測特定神經遞質的濃度變化。此外，該探針成功實現了在不同生物體系中對內源乙酰膽堿信號的實時監測，為深入研究乙酰膽堿的功能提供了重要工具。
圖1.第一代乙酰膽堿熒光探針GACh的開發
論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/nbt.4184
2020年9月28日，李毓龍實驗室和北京腦科學與類腦研究中心的井淼研究員合作，在Nature Methods期刊上發表了題為“An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity”的研究論文。在該研究中，研究團隊在前期工作基礎上，成功優化出新一代乙酰膽堿熒光探針（ACh3.0）。與第一代探針相比，新版本的ACh3.0信號幅度提升了3倍以上，并且還具備親和力高、反應速率快以及選擇性強等特征，進一步提升在體乙酰膽堿實時特異檢測的信噪比。
圖2.優化后的新一代乙酰膽堿熒光探針
論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-0953-2
02 多巴胺多巴胺（Dopamine, DA）作為大腦中一種重要的單胺類神經遞質，在中樞神經系統中發揮了重要調節功能，參與學習、記憶、情緒、注意力、動機、運動控制等生理過程，并與帕金森病、成癮、精神分裂癥、多動癥和創傷后壓力綜合征等多種神經系統疾病密切相關。實時檢測活體內特定腦區的DA信號變化，有助于更好地理解DA在生理和病理過程中起到的作用。2018年7月12日，李毓龍實驗室在Cell期刊發表題為“A genetically-encoded fluorescent sensor enables rapid and specific detection of dopamine in flies, fish, and mice”的研究論文。在該研究中，課題組開發了一種新型、可基因編碼的綠色熒光DA探針GRABDA，該探針以環化重排綠色熒光蛋白（cpEGFP）為基礎，將DA化學信號轉化為熒光信號，從而實現了對DA濃度動態變化的實時監測。此后該探針的檢測性能在果蠅、斑馬魚和小鼠體內得到了充分的驗證，表明該探針可作為研究多巴胺能神經環路功能的重要手段。
圖3.第一代綠色熒光多巴胺探針的開發
論文原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.06.042
2020年10月22日，李毓龍實驗室與美國紐約大學和美國國立衛生研究院合作，在Nature Methods期刊上發表了題為“Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo”的研究論文。該研究在第一代綠色熒光DA探針的基礎上，開發出了新型具有紅色熒光的DA探針（rGRABDA1m和rGRABDA1h），以便與其它綠色熒光探針進行同時監測。此外，該研究還構建了具有更高靈敏度以及更高成像信噪比的第二代綠色熒光DA探針（GRABDA2m和GRABDA2h），與第一代相比，其反應幅度提升了2-3倍。
圖4.紅色熒光多巴胺探針和第二代綠色熒光多巴胺探針的開發
論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41592-020-00981-9
03 去甲腎SHANG腺素去甲腎SHANG腺素（Norepinephrine, NE）是一種重要的單胺類神經遞質，參與了中樞神經系統和交感神經系統中的多種生理過程，與感覺、學習、記憶、注意力、睡眠等行為以及精神疾病和神經退行性疾病有關。因此，實時精確監測去甲腎SHANG腺素的動態分布，對于研究人員探討NE的生理和病理功能十分關鍵。2019年3月25日，李毓龍實驗室在Neuron期刊上發表了題為“A genetically encoded fluorescent sensor for rapid and specific in vivo detection of norepinephrine”的研究論文。該研究首次成功開發了具有極高的分子特異性和時空分辨率的、可基因編碼的NE熒光探針（GRABNE）。基于環化重排綠色熒光蛋白（cpEGFP），該探針可實時監測體外NE濃度的動態變化情況，并成功在斑馬魚和小鼠體內得到驗證。此外，具有不同親和力的兩種版本的熒光探針（分別命名為NE1m和NE1h），還可分別用于局部突觸傳遞和非局部非突觸傳遞的NE釋放的檢測。
圖5.去甲腎SHANG腺素熒光探針工作原理和應用示意圖
論文原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2019.02.037
04 腺苷細胞外腺苷（adenosine, Ado）在體內廣泛的生理過程中發揮重要作用，包括睡眠-覺醒周期、學習記憶、心血管功能和免疫反應等。腺苷信號傳導受損與多種疾病有關，如疼痛、癲癇、卒中、藥物成癮和神經退行性疾病等。在大腦中，腺苷通過激活不同的G蛋白耦聯的腺苷受體，在突觸水平發揮神經調節或穩態調節的作用。盡管腺苷的功能已被廣泛研究，但是由于缺乏能夠精確而又靈敏地檢測體內腺苷的方法，其在大腦中的釋放機制仍不清楚。2020年9月4日，通過與李毓龍實驗室合作，中科院腦智卓越創新中心徐敏研究員課題組在Science期刊上發表了題為Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons的研究論文。在該研究中，為了檢測睡眠覺醒周期中大腦特定區域胞外腺苷濃度，李毓龍團隊開發了一種高靈敏性、高特異性和高時間分辨率的新型可遺傳編碼的腺苷探針（GRABAdo）。利用該探針，結合光纖記錄、光遺傳學等技術，該研究揭示了基底前腦區域谷氨酸能神經元在調控腺苷動態變化和睡眠穩態中的關鍵作用，為進一步研究睡眠穩態的調節機制奠定了基礎。
圖6.腺苷快速釋放和睡眠穩態的神經調控
論文原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.abb0556
05 5-羥色胺5-羥色胺（5-HT）是一種重要的單胺類神經遞質，廣泛分布于中樞神經系統和外周組織。5-HT可以調節進食、睡眠、學習記憶、情緒、社交等多種行為，而5-HT系統失調則會引起多種精神疾病，包括抑郁癥、創傷后應激障礙以及成癮等。為進一步闡明5-HT的生理功能以及探討其在相關疾病中的治療意義，李毓龍團隊開展了開發精確而高時空分辨監測5-HT動態變化方法的工作。2021年4月5日，李毓龍實驗室在Nature Neuroscience期刊上發表了題為“A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics”的研究論文。在該研究中，課題組沿用了之前的熒光探針構建策略，成功開發出新型、高靈敏度、高特異性以及反應動力學速率可達亞秒級別的5-HT熒光探針（GRAB5-HT1.0），并且作者還分別在果蠅和小鼠中對探針功能進行了檢測，證明5-HT熒光探針具有廣泛應用的普適性。
圖7. 5-HT熒光探針的開發和優化
論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41593-021-00823-7
06 內源DA麻素內源DA麻素（endocannabinoids, eCBs）是由神經元合成和釋放的一類脂類神經調質分子。與經典神經遞質的釋放不同，eCBs在突觸后神經元釋放，逆行性地作用于突觸前膜DA麻素受體上，發揮突觸前抑制作用。eCBs參與了大腦多個區域的突觸可塑性調節以及獎賞、能量代謝、學習記憶、睡眠覺醒等多種生理過程，還和神經退行性疾病、癲癇、成癮、抑郁癥等多種疾病密切相關。2021年11月11日，李毓龍實驗室在Nature Biotechnology期刊上發表了題為“A fluorescent sensor for spatiotemporally resolved imaging of endocannabinoid dynamics in vivo”的研究論文，在該研究中，課題組采用其先前GRAB探針構建策略，首次成功開發出高時空分辨率的eCBs熒光探針（GRABeCB2.0）。這種新型eCBs熒光探針具有高靈敏度、高選擇性和高動力學特性，可用于檢測體外培養神經元、急性腦切片和體內特定腦結構在生理和病理活動期間的eCBs釋放。
圖8.內源DA麻素熒光探針的開發
論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-021-01074-4
07 三磷酸腺苷三磷酸腺苷（ATP）等嘌呤類分子廣泛存在于細胞內外，胞內的嘌呤類分子主要負責調節細胞能量代謝；而胞外的嘌呤類分子則作為信號分子，參與到睡眠、味覺感受、呼吸調控等生理活動過程。嘌呤能信號還與抑郁、精神分裂、癲癇、疼痛、炎癥等疾病有關。2021年12月22日，李毓龍實驗室在Neuron期刊上發表了題為“A sensitive GRAB sensor for detecting extracellular ATP in vitro and in vivo”的研究論文。該研究沿用先前設計的GRAB探針策略，開發了一種新型、高時空分辨率且可遺傳編碼的ATP熒光探針（GRABATP1.0），該探針能夠高靈敏度地檢測腦組織中ATP的動態變化，可以實時可視化監測體外或在體ATP的胞外釋放。
圖9. ATP熒光探針的工作原理和應用示意圖
論文原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.neuron.2021.11.027
08 催產素催產素（Oxytocin, OT）是哺乳動物體內分布于內分泌系統和中樞神經系統中的一種十分重要的神經肽，在調節分娩、哺乳、交配、母嬰關系和社會認知等行為中發揮了關鍵作用。構建高靈敏度、高特異性的分子探針來快速準確地追蹤其動態變化，對于深入理解催產素的功能以及作用機理十分關鍵。2023年1月2日，李毓龍實驗室在Nature Biotechnology期刊上發表了題為“A genetically encoded sensor measures temporal oxytocin release from different neuronal compartments”的研究論文。在該研究中，團隊沿用已有的GRAB探針策略，成功構建出一種新型、高靈敏度、高信噪比、快速響應的催產素熒光探針（GRABOT1.0）。利用該探針，作者成功在自由活動的小鼠中檢測到催產素神經元激活引起的催產素釋放，并深入探究了催產素釋放的分子機制。
圖10.催產素熒光探針的開發
論文原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41587-022-01561-2
基于龐大的GPCR家族，李毓龍課題組正在開發并且得到了更多神經遞質或神經調質的多色探針，包括小分子、肽類和脂類等。課題組開發的工具樂于分享給研究人員使用，歡迎大家聯系試用，具體可參見：
http://www.yulonglilab.org
李毓龍，男，北京大學生命科學學院教授，北大-清華生命科學聯合中心、北京大學-IDG/麥戈文腦科學研究所研究員，博士生導師、國家杰出青年基金獲得者。課題組致力于開發新型神經成像技術，用于在時間和空間尺度上解析神經系統的復雜功能，探究生理及病理條件下突觸傳遞的調節機制。研究成果入選2018年中國生命科學十大進展、2018年中國十大醫學科技新聞，曾獲張香桐神經科學青年科學家獎、中源協和生命醫學創新突破獎、首屆“科學探索獎”、首屆峰基金支持、談家楨生命科學獎、第二十屆吳階平-保羅·楊森醫學創新獎（吳楊獎）、勃林格殷格翰研究員獎、教育部基礎學科拔尖學生培養計劃“優秀導師獎”等獎項。受邀請在美國神經生物協會年會、美國遺傳協會果蠅年會等國際重大會議做學術報告并撰寫多篇綜述。
