Introduction

樣品制備過程中的蛋白損失是生物學(xué)、生物技術(shù)和生物制藥領(lǐng)域獲得可靠定量結(jié)果的障礙。但在工藝開發(fā)或監(jiān)視過程中進(jìn)行分析就需要將此類損失保持在最低水平，以便獲得可靠的結(jié)果。通過選擇適當(dāng)?shù)臑V膜，可在樣品制備過程中，在廣泛的條件內(nèi)實(shí)現(xiàn)很小的產(chǎn)品損失。
 
 
引言

生物藥樣品通常由含有細(xì)胞碎片或蛋白質(zhì)聚體等不溶性顆粒的原料制成，因此在分析之前需要進(jìn)行固液分離以保護(hù)分析儀器。由于離心分離需要固相和液相之間存在密度差異，所以最好的方式是進(jìn)行樣品過濾，讓膜過濾器提供絕對的顆粒截留。但是濾膜會吸附蛋白質(zhì)等分析物，從而影響后續(xù)分析的結(jié)果。因此，選擇具有最小蛋白質(zhì)吸附的濾膜至關(guān)重要。吸附不僅取決于膜類型，還受到pH和表面電荷等樣品和蛋白質(zhì)特性，以及特定處理步驟的影響。我們選擇了四種典型的針頭濾器，并在各種樣品條件下，測定了包含兩種不同抗體在內(nèi)的四種模型蛋白質(zhì)的回收率，以滿足眾多生物、生物技術(shù)和生物制藥應(yīng)用的要求。
 
 
材料和方法

使用四種模型蛋白質(zhì)研究濾膜的蛋白質(zhì)吸附（表1）。


表1

建立了具有 120 個(gè)測試的裂區(qū)實(shí)驗(yàn) | 最優(yōu)設(shè)計(jì)，其中包含四個(gè)數(shù)值和兩個(gè)分類因素（表2）；通過混合線性二次模型研究針頭濾器不同膜的蛋白質(zhì)吸附性。
 

表2
  
 
結(jié)果與討論

統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（DoE）用于測定四種模型蛋白結(jié)合情況與四種不同類型針頭濾器濾膜（均具有0.2 μm的孔徑）的結(jié)合，通常用于樣品制備，例如工藝過程中控制。醋酸纖維素（CA）膜（Minisart®，表3）的最高蛋白質(zhì)回收率 > 98 %，并未顯著高于于聚醚砜（PES）膜（Minisart® High Flow）的平均回收率（雙側(cè)t檢驗(yàn)具有 0.05 的顯著性水平）。此外，與尼龍和聚偏二氟乙烯膜相比，兩種膜均顯示出低 3 至 8 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差，這表明：即使對于不同的樣品條件和靶蛋白質(zhì)，這些膜也能實(shí)現(xiàn)高回收率（表2）。
 

表3  0.2 μm孔徑過濾器的特性以及過濾后與膜類型相關(guān)的平均蛋白質(zhì)回收率。

在分析 DoE 時(shí)，樣品量，尤其是蛋白質(zhì)濃度對蛋白質(zhì)回收率的影響最大，且隨著濃度和體積的增加而增加（圖1）。在這一模型中，給定的表面將結(jié)合一定數(shù)量的蛋白質(zhì)，因此（相對）回收率隨樣品量和濃度的增加而增加。因此，大體積和高濃度可以減少使用針頭濾器進(jìn)行樣品制備過程中產(chǎn)品損失的百分比。


圖1 使用基于膜的針頭濾器的平均蛋白質(zhì)回收率。在電導(dǎo)率為 32.5mS cm-1，pH 為 6.5 條件下，使用醋酸纖維素（A）、聚醚砜（B）、尼龍（C）和聚偏二氟乙烯（D）膜，對蛋白質(zhì) RFP、mAb1、mAb2 和 RuBisCO 的回收率進(jìn)行平均。

膜類型也會產(chǎn)生相關(guān)影響，與尼龍或聚偏二氟乙烯（PVDF）制成的膜相比，由CA或PES制成的膜表現(xiàn)出明顯更少的蛋白質(zhì)吸附（回收率 > 95 %），尤其適用于低濃度和樣品量（PVDF）制成的膜相比（回收率 < 75 %）（圖1）。因此，如果靶蛋白稀缺，由CA或PES構(gòu)成的膜可以幫助降低樣品制備過程中的產(chǎn)品損失。pH效應(yīng)很大程度上取決于蛋白質(zhì)。
 
 
結(jié)論

大多數(shù)樣品處理或制備都會導(dǎo)致產(chǎn)品損失，但是通過選擇適當(dāng)?shù)臑V膜，可在樣品制備過程中，在廣泛的條件內(nèi)實(shí)現(xiàn)很小的產(chǎn)品損失。例如，使用Minisart® NML（CA）或 Minisart® High Flow（PES）濾膜可回收約 90 %的產(chǎn)品。還可以通過微調(diào)單個(gè)產(chǎn)品的樣品條件來進(jìn)一步提高產(chǎn)品回收率，例如選擇適當(dāng)?shù)?pH 值。相比之下，如果蛋白質(zhì)結(jié)合有利于樣品制備，則可以使用尼龍膜，例如Minisart® NY。

Minisart® 針頭濾器


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本篇《如何提高關(guān)鍵蛋白質(zhì)樣品的回收率》應(yīng)用說明比較了樣品制備過程中比較常用的4種不同膜材質(zhì)的針頭濾器，說明能夠在樣品制備過程中顯著降低分析物損失的條件和膜類型。


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