AbbVie靶向蛋白降解IRAK3靶點成藥性研究進展講解

瀏覽次數：2760　發布日期：2022-6-10　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

對傳統小分子抑制劑，假激酶IRAK-3是比較難成藥性靶標。AbbVie公司科學家利用CRISPR/Cas9技術和PROTAC蛋白降解技術選擇性敲除或降解單核細胞衍生的樹突狀細胞中IRAK3，導致1L-12p40表達增加，誘導 T 細胞反應并導致腫瘤生長抑制，IRAK3可能成為蛋白降解劑研究的新靶點。

白細胞介素-1受體相關激酶(interleukin-1 receptor-associated kinases, IRAKs)蛋白家族由IRAK1、IRAK2、IRAK3（IRAK-M）和IRAK4四種同工酶組成，介導白細胞介素1受體（IL-1R）和Toll樣受體（TLR）信號通路。活化的TLR/IL1R導致Myddosome組裝，這是一種由MyD88、IRAK4和IRAK2組成的多蛋白復合物，它通過 IRAK4 依賴性磷酸化激活絲氨酸/蘇氨酸激酶 IRAK1。IRAK1 與 E3 泛素連接酶 TRAF6 結合，后者介導 IKK 復合物的激活，導致 NF-κB 靶基因的轉錄。IRAK1/TRAF6 復合物還可以通過組裝具有催化活性的 TAB2-TAB3-TAK1 復合物來激活 JNK 和 p38 信號傳導。在單核細胞和巨噬細胞中，IRAK3 通過抑制 IRAK4 和 IRAK1 的激活負向調節 IRAK 信號傳導。

IRAK1和IRAK4是組織中廣泛表達的經典激酶，而IRAK3是一種假激酶，只在骨髓細胞系中表達，缺乏激酶活性。迄今為止，沒有傳統小分子抑制劑靶向IRAK3，2020年，Degorce等報道了第一個選擇性降解IRAK3靶點的PROTAC分子，但相關研究沒有揭示降解后功能變化。IRAK3作為TLR通路的負調控因子，可能會降低先天免疫反應。在腫瘤微環境中，敲除IRAK3顯示骨髓細胞功能增強以促進抗腫瘤響應。與腫瘤細胞共培養的單核細胞顯示 TNF-α、IL-12 和 IRAK1 表達降低，但 IRAK3 表達增加。相反，與野生型 (WT) 樹突狀細胞（DCs）相比，IRAK3-/-小鼠樹突狀細胞的促炎細胞因子表達增加，從而誘導 T 細胞反應并導致腫瘤生長抑制，降解IRAK3可能成為免疫腫瘤治療中一個有吸引力新策略。IL-12是由活化的樹突狀細胞和巨噬細胞產出的主要促炎細胞因子，通過誘導促IFN-γ細胞因子，在促進Th1介導的抗腫瘤反應、T細胞活化和增殖中發揮重要作用。

通過CRISPR/Cas9基因編輯技術和PROTAC選擇性降解IRAK3來研究后續DCs中功能和表型變化。根據下圖在人單核細胞衍生的樹突狀細胞中基因編輯敲除IRAK3基因，采用基于毛細管電泳技術的Digital Western（也稱為Simple Western Wes系統）驗證基因敲除效率，2個供體顯示完全敲除，另一個顯示保留10% IRAK3蛋白表達，結果顯示通過CRISPR/Cas9 RNP方法有效降低了DCs中IRAK3蛋白表達水平。敲除了IRAK3后，在脂多糖（LPS）刺激后，通過檢測細胞上清液中細胞因子分泌水平，結果顯示IL-12p40分泌顯著增加，與對照相比，濃度增加了1.5到2倍。同時IL-12p70分泌也具有增長趨勢，但IL-10沒有影響。

通過系列體外實驗，篩選到一個選擇性降解IRAK3的PROTAC苗頭化合物，D-1。無論有無LPS刺激時，采用D-1處理原代人DCs都可實現濃度依賴性IRAK3選擇性降解，24h實現最大降解活性。進一步檢測分泌細胞因子濃度水平變化，在100 ng/mL LPS刺激時，IL-12p40細胞因子濃度隨著降解劑濃度依賴性增加。

采用PROTAC D-1和LPS處理的DCs中IL-12p40濃度增加與CRISPR/Cas9 KO實驗結果一致的，證明了兩種方法有效性，證明通過PROTAC蛋白降解劑對IRAK3靶點可成藥性。通過深入了解研究IRAK3生物學，擴大了PROTAC分子降解靶點庫，并支持了潛在治療靶點的基因編輯缺失和化學降解之間的相關性。

本研究主要利用Digital Western Blot技術檢測IRAK3靶蛋白表達水平，研究CRISPR/Cas9基因編輯技術和PROTAC蛋白降解技術處理后細胞蛋白表達，準確定量靶向蛋白降解研究過程量效關系。AbbVie公司研究再次證明了Digital Western Blot可快速地、可重復性精準定量內源性蛋白質表達，是PROTAC技術平臺構建的必備技術。

PROTAC 是 Arvinas, Inc. 注冊商標，其他商標和注冊商標是其各自所有者的財產。