樹突狀細胞（DCs）是主要的抗原呈遞細胞，在自身免疫性葡萄膜炎中發揮重要作用。新的證據表明，膽汁酸（BAs）調節DCs的成熟。然而，BAs調節DCs功能的潛在機制仍需進一步確定。
 

重慶醫科大學附屬第一醫院李鴻教授團隊等人于7月11日在農業與生物科學領域頂級期刊International Journal of Biological Sciences（IF 10.75）發表題為“Lithocholic acid inhibits dendritic cell activation by reducing intracellular glutathione via TGR5 signaling”的研究文章，利用轉錄組測序（中科新生命提供服務）、qPCR、ELISA和Western blot等技術對BAs調節DCs的功能機制進行研究，發現石膽酸（LCA）能通過激活TGR5信號來抑制DCs中谷胱甘肽（GSH）的產生并誘導氧化應激反應，下調NF-κB和MAPK途徑，從而抑制骨髓源性DCs（BMDCs）促炎細胞因子的產生并可導致DCs的凋亡和自噬。此外，本研究還發現LCA和TGR5激動劑可能是治療自身免疫性葡萄膜炎的潛在藥物。

 研究材料

TGR5^+/+和TGR5^-/-小鼠來源的BMDCs和視網膜組織、健康人和免疫性葡萄膜炎患者來源的MD-DCs

 技術路線

步驟1：LPS誘導并補充LCA后，BMDCs促炎細胞因子分泌水平、表面標志物和膽汁酸受體表達水平的檢測；

步驟2：siRNA抑制TGR5和FXR表達后，BMDCs促炎細胞因子分泌水平、表面標志物表達水平的檢測；

步驟3：補充LCA后，自身免疫性結膜炎小鼠模型（EAU）病理特征、免疫細胞和促炎細胞因子水平檢測；

步驟4：使用人源MD-DCs進行步驟1-3實驗結果的驗證；

步驟5：轉錄組測序檢測LCA處理后TGR5^+/+ vs TGR5^-/- BDMCs基因表達和功能富集差異；

步驟6：LCA和TGR5激動劑處理后，TGR5^+/+ vs TGR5^-/- BDMCs表型和分子特征檢測。

 研究結果
 

1. BAs可抑制促炎細胞因子的產生和DCs表面標志物的表達

LPS誘導BMDCs后，補充BAs能抑制幾種促炎細胞因子的分泌，并抑制BMDCs表面標記物CD40、CD86、CD80和MHCII的表達，其中LCA效果最為顯著（圖1）。

圖1 BAs可抑制促炎細胞因子的分泌和DCs表面標志物的表達

2. LCA通過TGR5信號抑制DCs促炎細胞因子分泌，減輕小鼠EAU的嚴重程度

QPCR結果表明，LCA誘導BMDCs中FXR和TGR5的mRNA表達，INT-777、747（TGR5特異性激動劑）顯著抑制BMDCs中促炎細胞因子的分泌（圖2 A、B）。使用siRNA抑制BMDCs中TGR5、FXR的表達，結果表明抑制TGR5表達能更大程度上逆轉LCA對細胞因子分泌的抑制作用，并在TGR5^-/- BMDC的體外實驗中發現了類似的結果（圖2 C-G）。以上結果表明，LCA通過TGR5信號調節DCs的功能。

圖2 LCA通過TGR5信號通路抑制DCs中促炎細胞因子的分泌

此外，TGR5^+/+小鼠補充LCA可抑制小鼠病理表現、保護小鼠視網膜血管完整性、顯著改善EAU的嚴重程度并減緩其進展，TGR5^-/-小鼠中這種效果則發生逆轉（圖3）。

圖3 LCA通過TGR5信號通路減輕小鼠EAU的嚴重程度

3. LCA通過TGR5信號通路抑制DCs的抗原呈遞功能及MD-DCs的激活

體外實驗表明，補充LCA的TGR5^+/+ EAU小鼠中分離的CD11c⁺ DCs顯著抑制Th17、Th1細胞的分化以及IFN-γ和IL-17的分泌，而這種現象在TGR5^-/-組中發生逆轉（圖4 A-C）。體內實驗（小鼠脾臟和視網膜組織）觀察到類似的結果（圖D-E）。

圖4 LCA通過TGR5信號通路抑制DCs的抗原呈遞功能

人源MD-DCs細胞體外培養實驗進一步驗證了上述結果（圖5）。

圖5 LCA通過TGR5信號抑制MD-DCs的激活

4. TGR5信號通過抑制GSH的產生和誘導氧化應激反應來抑制DCs產生促炎細胞因子

對LPS誘導并補充LCA處理后的TGR5^+/+ vs TGR5^-/- BDMCs進行RNA-Seq，共檢出1584個DEGs（其中上調641個，下調943個）。KEGG pathway富集分析顯示TGR5^+/+組中24條途徑上調（如核糖體表達、GSH代謝途徑等），12條途徑下調（如磷脂酰肌醇信號系統、HIF-1信號通路等）（圖6）。

圖6 TGR5信號通路調節DCs內GSH代謝

通常GSH缺乏會抑制DCs成熟和促炎細胞因子的產生，體外實驗表明補充LCA和INT-777、747可顯著抑制TGR5^+/+組細胞內抗氧化酶活性（包括GSH過氧化氫酶、過氧化物酶等），誘導ROS積累，而TGR5敲除則會逆轉這些結果（圖7 A-D）。使用GSH還原型乙酯（GSH OEt）增加TGR5^+/+ BMDCs中GSH的表達后，促炎細胞因子分泌水平增加（圖7 E）。

圖7 TGR5的激活通過抑制GSH的產生、誘導氧化應激來抑制DCs中促炎細胞因子的分泌

5. LCA通過TGR5信號通路促進DCs凋亡和自噬

相較于TGR5^-/-，補充LCA增加了TGR5^+/+ BMDCs中膜聯蛋白+7AAD細胞的比例，并增加與細胞凋亡相關蛋白Bax和C-caspase3的表達，降低BCL-2的表達（圖8 A-C）。此外，LCA增加了參與自噬的2種蛋白LC3II/LC3I比率和Beclin1的表達（圖8D）。這些結果表明LCA可促進BMDCs凋亡和自噬。

圖8 LCA通過TGR5信號通路促進DCs的凋亡和自噬

 小編小結

本研究表明，BAs抑制DCs中促炎細胞因子和表面標志物的表達，LCA效果最為突出，其中TGR5是LCA最有效的下游靶點。LCA通過TGR5信號抑制DCs激活，通過減少GSH產生，下調NF-κB和MAPK途徑從而降低促炎細胞因子分泌，并促進DCs凋亡和自噬，以調節自身免疫性葡萄膜炎的發展。此外，本文研究結果表明，LCA和TGR5激動劑是治療自身免疫性疾病和炎癥性疾病（包括自身免疫性葡萄膜炎）的潛在治療藥物。