相較于傳統3D技術方法，基于4D平臺的蛋白質組學無論是在鑒定深度還是準確性上都能帶來全面的提升。關于4D蛋白質組學，小編在上期- 關于4D蛋白質組學，你想知道的那些事兒（一）為大家帶來了關于4D-shot gun的Q&A，今天一起來看看對于4D-Label free又有哪些常見問題吧。

篇章二 
4D-Label free：不需要對樣品進行任何標記，每個樣品可單獨上機。利用DDA采集模式分析直接酶解后的蛋白肽段，獲得蛋白質表達量變化情況，對蛋白進行定性定量分析。


同步累積連續碎裂（PASEF®）示意圖。timsTOF Pro質譜儀的PASEF策略，離子在第一個TIMS分析器中進行累積和聚焦，同時第二個TIMS分析器對肽段進行淌度分離和逐步釋放。
圖片來源：BRUKER


Q1：為什么叫做Label free？
A：提到Label free就不得不提到iTRAQ和TMT，iTRAQ和TMT分別是由Thermo Fisher和AB SCIEX研發的多肽體外標記定量技術，也是運用廣泛的兩種標記定量蛋白質組技術，具有相似的原理，兩者主要區別在于：TMT最高可同時標記16組不同的生物樣品，iTRAQ最高可同時標記8組不同的生物樣品。

與上述兩種多肽體外標記定量技術不同，Label free無需使用昂貴的穩定同位素標簽做內部標準，每個樣品單獨上機，只需分析大規模鑒定蛋白質時所產生的質譜數據，比較不同樣品中相應肽段的信號強度，從而對肽段對應的蛋白質進行相對定量。其優勢是無需依賴同位素標記，每例單獨檢測，因此實驗設計靈活，適合臨床大幾十例、上百例樣本的檢測，同時也能看到樣本中的“有還是無”的蛋白。缺點是對儀器的穩定性、實驗人員的操作等可能產生系統誤差的因素要求極高。

Q2：4D-Label free為什么更具優勢？
A：Label free每條肽段的豐度（量）與其在MS1中的峰面積或信號強度成正比；而不同樣品的同一條肽段在LC上的保留時間（retention time, RT）是一致的，因此，可以通過對比MS圖譜，再整合到相應蛋白，實現對蛋白質在不同樣品中的相對表達水平的定量分析。由于常規DDA模式的Label free是基于topN的方法挑選母離子進行二級碎裂的，所以難免會損失一些豐度較低的信號。4D-Label free由于增加了第四個維度-離子淌度（mobility）作為額外的一個數據對齊參數顯著減少了missing value，提高定量的準確性，因此定性和定量數據更穩定。

      蛋白質磷酸化修飾調節著蛋白質的活性狀態、定位、折疊以及蛋白質-蛋白質之間的交互作用等。許多至關重要的生命進程不僅由蛋白質的相對豐度控制，更重要的是被那些時空特異分布的翻譯后修飾控制。因此，除了對基因組所編碼的“裸”蛋白質組的研究以外，更需要對經過翻譯后修飾的蛋白質及蛋白質組的調控過程進行深入的研究。由于磷酸化修飾會導致空間結構的微變化，常規3D分析不能完全區分，所以離子淌度（mobility）的引入使得4D-label free磷酸化鑒定更具優勢。


Q3：4D-Label free有哪些應用研究案例？
A：案例一：In-depth proteomics and natural peptidomics analyses reveal antibacterial peptides in human endometrial fluid
摘要：2020年，西班牙巴斯克地區大學的研究團隊對子宮內膜液的蛋白質和天然肽進行了全面分析。使用高靈敏度的4D label free蛋白質組學技術分析了來自11個個體的樣品的蛋白質含量。鑒定了4694種蛋白質以及3899種天然存在的肽。實驗結果大大擴展了已知子宮內膜液蛋白質的目錄，并提供了關于這種子宮內膜液中天然肽含量的大量新信息。

案例二：Quantitative Proteomic Analysis of Chikungunya Virus-Infected Aedes aegypti Reveals Proteome Modulations Indicative of Persistent Infection
摘要：蚊子傳播的奇昆古尼亞病毒（CHIKV）對全世界熱帶國家的人類健康構成威脅。2020年美國密蘇里大學的研究團隊利用高靈敏度的4D label free蛋白質組學技術對感染和未感染的CHIKV的埃及伊蚊樣本中鑒定出2647至3167種蛋白質，揭示了蚊子體內與CHIKV相互作用的生物途徑和新蛋白質。總的來說，CHIKV感染引起蚊子蛋白質組的微小變化，表明載體和病毒之間高度適應，基本上以非致病關系共存。

案例三：In-depth proteomic analysis of Plasmodium berghei sporozoites using trapped ion mobility spectrometry with parallel accumulation-serial fragmentation
摘要：2021年法國索邦大學研究團隊利用高靈敏度的4D label free蛋白質組學技術，結合三種不同的子孢子純化方法，利用少量寄生蟲鑒定伯氏瘧原蟲子孢子的蛋白質組。這項研究為伯氏瘧原蟲子孢子提供了一個參考蛋白質組，確定了一組跨物種表達的核心蛋白質，并說明了timsTOF PRO系統前所未有的靈敏度如何能夠從有限的樣本量進行深度蛋白質組分析。

案例四：Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis
摘要：2021年，美國普渡大學研究團隊基于新優化的分離方法——BiMBs方法，能夠高效地從尿液中分離出細胞外囊泡，該方法具有低污染、高回收率以及分離時間短等優點。同時，結合高靈敏度的4D label free蛋白質組和4D label free磷酸化蛋白質組等新技術對前列腺癌患者和健康個體尿液外囊泡分析，找到一系列疾病相關的磷酸化蛋白質，表明其在臨床研究中的巨大應用潛力。

案例五：Ultrafast and Reproducible Proteomics from Small Amounts of Heart Tissue Enabled by Azo and timsTOF Pro
摘要：2021年美國威斯康星大學麥迪遜分校的研究團隊開發了一種超快速自下而上的4D label free蛋白質組學技術方法，該方法由Azo（偶氮,一種可光裂解的、與質譜兼容的表面活性劑，可有效溶解蛋白質并促進快速胰蛋白酶消化）與Bruker timsTOF Pro相結合，通過捕獲離子遷移譜（TIMS）和肽的平行積累-串聯片段化（PASEF）實現更深的蛋白質組覆蓋。應用這種方法來分析復雜的人類心臟蛋白質組，從少至1毫克的人類心臟組織中鑒定了近4000個蛋白質組，具有高重現性。總的來說，作者預計這種由Azo和timsTOF Pro支持的超快速、穩健和可重復的自下而上方法將普遍適用，并大大加快大規模定量蛋白質組學研究的吞吐量。

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