RT-PCR，全稱反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR）是將RNA的反轉(zhuǎn)錄和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。

實(shí)驗(yàn)原理是在試管內(nèi)，以變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)為一個循環(huán)，反復(fù)重復(fù)這種循環(huán)，使DNA得以擴(kuò)增。其目的是檢測核酸的表達(dá)，主要是RNA的表達(dá)，DNA不需要反轉(zhuǎn)錄的過程，直接PCR檢測即可。

RT-PCR操作步驟：

1. RNA抽提
方法：TRlzol法。
主要成分：苯酚（具有裂解細(xì)胞和變性蛋白的作用）。
RNA抽提前準(zhǔn)備：試劑耗材準(zhǔn)備（注意RNase free）、樣品的準(zhǔn)備。
步驟：樣品+1ml TRlzol室溫裂解10min+200μL氯仿振蕩30s后室溫靜置2-3 min；4℃低溫離心（12 000g×20min）；400μL上層水相+600μL異丙醇室溫沉淀10min；4℃低溫離心（12 000g×20min）；75%乙醇沖洗；晾干沉淀，DEPC-treated水溶解。

2. RNA 質(zhì)量檢測
方法：分光光度計測定、凝膠電泳法

3. 反轉(zhuǎn)錄
是以RNA為模板合成cDNA的過程。在這個過程中遺傳信息的流動方向和轉(zhuǎn)錄時相反，所以稱為“反轉(zhuǎn)錄”。在這個過程中需要一個反轉(zhuǎn)錄酶，合成的DNA稱為與RNA互補(bǔ)的DNA（complementary DNA, cDNA）。這個過程中根據(jù)不同的情況選擇不同的反轉(zhuǎn)錄引物，如果要檢測的RNA有poly A尾巴，可以用Oligo(dT)做反轉(zhuǎn)錄引物；如果要檢測的RNA沒有poly A尾巴，就用隨機(jī)引物（random primer）來反轉(zhuǎn)；如果要檢測的RNA序列已知，可用特定引物（specific primer）來反轉(zhuǎn)。
 


提高RT-PCR反應(yīng)體系的靈敏度​：

1、分離高質(zhì)量RNA
成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑如EDTA或SDS等，以及盡可能減少基因組DNA污染。RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的大值。
 
2、使用無RNaseH活性的逆轉(zhuǎn)錄酶
在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中經(jīng)常加入RNase抑制劑以增加cDNA合成的長度和產(chǎn)量。不管是M-MLV還是AMV，在本身的聚合酶活性之外，都具有內(nèi)源RNaseH活性。RNaseH活性同聚合酶活性相互競爭RNA模板與DNA引物或cDNA延伸鏈間形成的雜合鏈，并降解RNA：DNA復(fù)合物中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物，降低了cDNA合成的產(chǎn)量和長度。因此消除或大大降低逆轉(zhuǎn)錄酶的RNaseH活性將會大有裨益。
 
3、提高逆轉(zhuǎn)錄保溫溫度
較高的保溫溫度有助于RNA二級結(jié)構(gòu)的打開，增加了反應(yīng)的產(chǎn)量。對于多數(shù)RNA模板，在沒有緩沖液或鹽的條件下，將RNA和引物在65℃保溫，然后迅速置于冰上冷卻，可以消除大多數(shù)二級結(jié)構(gòu)，從而使引物可以結(jié)合。
 
4、促進(jìn)逆轉(zhuǎn)錄的添加劑
包括甘油和DMSO在內(nèi)的添加劑加到*鏈合成反應(yīng)中，可以減低核酸雙鏈的穩(wěn)定并解開RNA二級結(jié)構(gòu)，多可以加入20%的甘油或10%的DMSO而不影響SuperScriptⅡ或M-MLV的活性。AMV也可以耐受多20%的甘油而不降低活性。
 
5、RNaseH處理 
在PCR之前使用RNaseH處理cDNA合成反應(yīng)可以提高靈敏度。對于某些模板，在cDNA合成反應(yīng)中的RNA會阻止擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合，在這種情況下，RNaseH處理可以增加靈敏度。一般當(dāng)擴(kuò)增較長的全長cDNA目標(biāo)模板時，RNaseH處理是必需的，比如低拷貝的tuberous scherosisⅡ。對這種困難模板，RNaseH的處理加強(qiáng)了SuperScriptⅡ或AMV合成的cDNA所產(chǎn)生的信號。對于多數(shù)RT-PCR反應(yīng)，RNaseH處理是可選的，因?yàn)?5℃保溫的PCR變性步驟一般會將RNA：DNA復(fù)合物中的RNA水解掉。
 
6、小量RNA檢測方法的提高 
當(dāng)僅有小量RNA時，RT-PCR尤其具有挑戰(zhàn)性。在RNA分離過程中加入的作為載體的糖元有助于增加小量樣品的產(chǎn)量。可以在加入Trizol的同時加入無RNase的糖元。對于小于50mg的組織106個培養(yǎng)細(xì)胞的樣品，無RNase糖元的建議濃度為250μg/ml。在使用SuperScriptⅡ的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中加入乙酰化BSA可以增加靈敏度，而且對于小量RNA，減少SuperScriptⅡ的量并加40單位的RnaseOut核酸酶抑制劑可以提高檢測的水平。如果在RNA分離過程中使用了糖元，仍然建議在使用SuperScriptⅡ進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時加入BSA或RNase抑制劑。
 
7、減少基因組DNA污染
RT-PCR所遇到的一個潛在的困難是RNA中有基因組DNA污染，可以在逆轉(zhuǎn)錄之前使用擴(kuò)增級的DNaseⅠ對RNA進(jìn)行處理以除去沾染的DNA。將樣品在2.0mM EDTA中65℃保溫10分鐘以終止DNaseⅠ消化。EDTA可以螯合鎂離子，防止高溫時所發(fā)生的依賴于鎂離子的DNA水解。為了將擴(kuò)增的cDNA同沾染的基因組DNA擴(kuò)增產(chǎn)物分開，可以設(shè)計分別同分開的外顯子退火的引物。來源于cDNA的PCR產(chǎn)物會比來源于污染的基因組DNA的產(chǎn)物短。另外對每個RNA模板進(jìn)行一個無逆轉(zhuǎn)錄的對照實(shí)驗(yàn)，以確定一個給定片段是來自基因組DNA還是cDNA。在無逆轉(zhuǎn)錄時所得到的PCR產(chǎn)物來源于基因組。