本文要點：第二近紅外窗口(NIR-II，1000-1700 nm)的熒光成像是一種非常有前途和研究活躍的技術，而利用NIR-II磷光進行光學成像的研究還很少。本文報道了一種聚集誘導的選擇性信號激活策略，該策略依賴于探針的輻射模式從弱熒光轉換為強NIR-II磷光。銅銦硒(Cu-In-Se)量子點在孤立狀態(tài)下發(fā)出極弱的熒光，其聚集態(tài)在≈1045 nm處顯著發(fā)光，發(fā)光壽命提高了2.7×103倍以上。用介孔二氧化硅納米顆粒(Cu-In-Se@MSN)包裹Cu-In-Se組裝，證實了聚集誘導的發(fā)射模式轉換，顯示出獨特的磷光型發(fā)射。NIR-II磷光信號使Cu-In-Se@MSN顯示出令人印象深刻的壽命成像，并且可以準確地確定血管的高階分支。對輻射模式轉換起源的研究不僅為理解光物理過程提供了新的視角，而且可能為設計智能NIR-II探頭奠定基礎。

方案1：聚集驅動的長壽命NIR-II磷光的示意圖.Cu-In-Se量子點在水中有很微弱的熒光，但聚集后在≈1045 nm處有很強的磷光發(fā)射，壽命長

在這項工作中，將親水性的非發(fā)光銅銦硒(Cu-In-Se)量子點轉換為高發(fā)光的Cu-In-Se聚集體，可以發(fā)射以≈1045 nm為中心的近紅外-II信號(方案1)。具有“開關”功能的NIR-II無機量子點以前沒有報道過。機理研究表明，AIE型Cu-In-Se量子點的熒光紅移歸因于主導輻射模式從微弱熒光向明亮磷光的轉變。此外，發(fā)展的近紅外第二代磷光成像是成像方式的研究前沿，通過最小化納秒級壽命的背景干擾，為高質量成像提供了多種強大的技術。NIR-II磷光成像擁有巨大的潛力，可以在沒有噪音的情況下專門監(jiān)測目標的清晰和深度。
 

圖1：Cu-In-Se量子點的結構表征a)溶劑誘導Cu-In-Se量子點的可逆聚集過程方案b-f)Cu-In-Se量子點在b-d)水和e，f)乙醇中的代表性TEM和AFM圖像g)Cu-In-Se量子點的HAADF-STEM圖像和相應的EDS元素映射

首先，透射電子顯微鏡(TEM)圖像(圖1b)和相應的尺寸分布直方圖均顯示所制備的Cu-In-Se量子點為球形，平均尺寸為4.6±0.8 nm。每個Cu-In-Se量子點在水中都表現(xiàn)出良好的單分散性。Cu-In-Se量子點可以被鑒定為CuInSe_2-In2Se。原子力顯微鏡(AFM)圖像直接證實了Cu-In-Se量子點的優(yōu)勢直徑小于5 nm(圖1D)，這與TEM分析一致。在添加乙醇或甲醇后，親水性的Cu-In-Se量子點會降低Cu-In-Se量子點的表面電荷，從而使這些量子點失去足夠的膠體穩(wěn)定性。

從圖1e，f中的全景透射電鏡圖像可以看出，以乙醇為溶劑產生了大量的聚集體，而放大的透射電鏡圖像表明，這些聚集體實際上是由定義良好的球形Cu-In-Se量子點填充的。以上分析證實，由于隨機聚集事件的存在，Cu-In-Se量子點的排列趨于不規(guī)則。重要的是，聚集的程度與Cu-In-Se量子點的發(fā)光類型(熒光或磷光，見下文)密切相關。為了進一步研究得到的Cu-InSe量子點的化學成分和微觀結構，進行了高角度環(huán)形暗場掃描透射電鏡(HAADF-STEM)(圖1g)。元素分布圖清楚地支持了Cu信號與Se信號共位，并與In信號部分分離。這與高分辨率TEM圖像的觀察結果一致(圖1c)。

圖2：Cu-In-Se量子點對溶劑變化的長壽命磷光響應.A)基于強度的NIR-II成像系統(tǒng)方案.B)近紅外圖像C)發(fā)射光譜和D)含不同體積分數乙醇的水/乙醇混合物中Cu In Se量子點的相應發(fā)射圖譜.E)Cu-In-Se量子點的光致發(fā)光峰(950和1045 nm)強度與乙醇體積分數的關系圖.F)分散在80%乙醇中的Cu-In-Se量子點的光致發(fā)光衰減曲線G)Cu-In-Se量子點在50%乙醇(頂板)和95%(底板)乙醇中的光致發(fā)光激發(fā)圖譜和H)依賴于激發(fā)的發(fā)射光譜.I)Cu-In-Se量子點在50%乙醇中的濃度依賴發(fā)射光譜

其次，在水中得到的Cu-In-Se量子點顯示出非常弱的PL響應(圖2a-d和表1)，這主要歸因于非輻射躍遷事件的存在。Cu-In-Se量子點以孤立物種的形式溶解(圖1b)，這可能導致它們的分子扭轉、振動和旋轉運動受到限制，從而猝滅了發(fā)射效率。然而，在Cu-In-Se量子點表現(xiàn)出相對較差穩(wěn)定性的乙醇中(圖1e)，可以觀察到發(fā)射強度和量子產率(表1)的顯著增強，這取決于乙醇在水中的體積分數。結合TEM和NIR-II成像的測量結果，Cu-In-Se量子點的聚集體越致密，發(fā)光越強，表現(xiàn)為典型的易自組裝的AIE現(xiàn)象。光致發(fā)光曲線逐漸分裂成雙峰型：以≈1045 nm為中心的新的≈-II發(fā)光帶和以水為中心的950 nm處的原始發(fā)光帶一起出現(xiàn)。

為了進一步研究上述光物理結果，808 nm的激發(fā)下，在Cu-In-Se量子點上進行了映射(圖2d)，顯示出熒光強度的顯著增加，隨著乙醇體積分數的增加，最亮的區(qū)域單調地移動到更長的波長，≈1045 nm處的近紅外-II發(fā)射信號呈指數增強，而≈950 nm熒光帶變弱，最終幾乎整合到新生成的近紅外-II帶中(圖2C)。相反，在≈1042 nm處(例如，在80%乙醇中的Cu-In-Se量子點)的近紅外-II發(fā)射呈三倍指數衰減，壽命為143.1µs，對應于慢得多的發(fā)射過程。Cu-In-Se量子點比先前存在的銅硫化物納米晶和金屬(Au，Ag，Pt等)具有顯著的近紅外-II壽命優(yōu)勢。此外，在≈950nm處極弱且壽命極短的熒光信號表現(xiàn)出熒光性質，這是由不同種類的孤立或松散組裝的Cu-In-Se量子點產生的。

表1：Cu-In-Se量子點的熒光光譜結果

圖3：Cu-In-Se量子點聚集時發(fā)出強而長壽命的近紅外-II磷光的可能機制.A)提出了分散態(tài)和聚集態(tài)Cu-In-Se量子點的能級結構.B)Cu-In-Se量子點的球差校正HAADF-STEM圖像.箭頭代表的是富In缺陷區(qū)，這也是Cu-In-Se量子點的卡通圖片

接著，為了進一步驗證Cu-In-Se量子點組裝的堆積程度是否對發(fā)射模式的改變有很大的影響，對分散在不同條件下的Cu-In-Se量子點進行了PL激發(fā)映射研究(圖2g)。在50%的乙醇中，當激發(fā)波長從650nm到808nm時，Cu-In-Se量子點的光致發(fā)光帶從≈850紅移到1050 nm以上，這清楚地表明了不同發(fā)光物種的存在。這種獨特的性質將使Cu-In-Se量子點在生物成像方面非常有用，短波吸收和散射的干擾最小。

與濃度相關的發(fā)射光譜也支持能夠誘導弱熒光轉換為明亮磷光的聚集事件(圖2I)。然而，隨著Cu-In-Se量子點濃度的不斷提高，在≈1045nm處出現(xiàn)了新的≈-II發(fā)光峰，而原來的NIR-II發(fā)光峰基本保持了其發(fā)射強度。盡管溶液在高濃度的Cu-In-Se量子點下仍保持均勻，但DLS測得的流體力學尺寸增加到≈200 nm，顯示出納米級聚集體的形成。上述觀察結果明確地表明，發(fā)光方式的改變與聚集的Cu-In-Se量子點的堆積程度有關。這種AIE參與的方案可能是一個因素，可以解釋存在于Cu-In-Se量子點溶液或其固體粉末中的磷光熒光發(fā)射的產生(表1)。接下來進行了微結構表征，以確定Cu-In-Se量子點中缺陷相關發(fā)射信號的可行性。球差校正的HAADF-STEM驗證了發(fā)育良好的晶體CuInSe2基質(圖3b)中富In缺陷的存在，這與高分辨率TEM結果(圖1c)證明的CuInSe2-In2Se3異二聚體組成一致。

圖4：基于所制備的Cu-In-Se量子點的長壽命NIR-II磷光探針的設計.A)介孔二氧化硅納米顆粒(MSN)包覆Cu-In-Se量子點的合成工藝示意圖.B)分別用5 mg和50 mg Cu-In-Se量子點制備的Cu-In-Se@MSN-1和C)Cu-In-Se@MSN-2 ,D)Cu-In-Se@MSN-2的HAADF-STEM圖像和相應的EDS元素映射.E)分散在水中的Cu-In-Se@MSN-2的激發(fā)相關發(fā)射光譜.F)分別在1041 nm和1060 nm處測量了Cu-In-Se@MSN-1和Cu-In-Se@MSN-2的光致發(fā)光衰減曲線.G)時間分辨近紅外-II成像系統(tǒng)和分散在不同體積分數乙醇和Cu-In-Se@MSN-1/2納米復合材料中的Cu-In-Se量子點的壽命圖像

然后，為了進一步驗證聚集度對發(fā)光性質的影響，嘗試固定了Cu-In-Se組裝的結構。如圖4a所示，通過將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)吸附到Cu-In-Se量子點的外表面，這種納米晶體可以從負電荷轉移到正電荷。二氧化硅前驅體(如正硅酸乙酯)水解、縮合，最終生成核殼結構納米復合材料(命名為Cu-In-Se@MSN)。Cu-In-Se@MSN-1和Cu-In-Se@MSN-2樣品均呈分散、均勻的球形，TEM尺寸(110±20 nm)無明顯差異。在每種納米復合材料中都有明顯的深色核存在，表明Cu-In-Se量子點被成功地包裹在介孔二氧化硅基質中，這表明Cu-In-Se量子點被成功地包裹在介孔二氧化硅基質中。HAADF圖和相應的元素圖譜表明，大部分Cu-InSe@MSN-2具有核@殼結構(圖4d)。綜上所述，與廣泛認可的疏溶劑相互作用控制的聚集形成鮮明對比的是，這里開發(fā)的耦合兩步序列方法(即量子點和二氧化硅涂層的自組裝)能夠同時執(zhí)行以下功能。首先，CTAB介導的自組裝使得Cu-In-Se量子點具有較高的聚集程度。其次，二氧化硅包覆步驟可以進一步將單個Cu-In-Se量子點緊密地包裹在一起，避免致密排列的崩塌。以上結果表明Cu-In-Se@MSN量子點聚集體的尺寸分布相對均勻。此外，Cu-In-Se@msn-2的壽命高達783.2µs(圖4f)。在水和95%乙醇中分別是原始Cu-In-Se量子點的1.3×105和4.8倍以上(表1)。Cu-In-Se量子點的長壽命衰減在很大程度上歸因于大量的Cu-In-Se量子點的緊密排列，它通過限制覆蓋配體的振動和旋轉，同時阻止了非輻射路徑，并激活了輻射衰減路徑。

Cu-In-Se量子點在80%或更多乙醇中的壽命成像可以很容易地識別背景信號，并具有一致的偽色，這表明長壽命近紅外-II磷光具有很高的可靠性。時間分辨NIR-II成像數據驗證了長壽命NIR-II磷光可以作為一種非常有用的工具來提高成像的準確度和精確度�；�于Rose標準，抗光漂白可以通過避免動態(tài)生物相關信息的丟失來提高活體成像的時間分辨率，特別是在連續(xù)長期生物成像的情況下。因此，需要驗證其穩(wěn)定性。在應用新制造的Cu-In-Se@MSN之前納米復合材料作為活體成像的探針，與分散在50%乙醇/50%胎牛血清混合物中的Cu-In-Se量子點的發(fā)光強度相比，在功率密度為0.14W cm2的808 nm激光照射2h后，Cu-In-Se@MSN-2在高鹽的PbS和FBS溶液中的光漂白作用可以忽略不計。此外，Cu-In-Se@MSN-2在37°C的熱PBS和FBS中的熒光強度在800min內表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，而未經二氧化硅包覆的Cu-In-Se量子點的光學性質在3h后明顯惡化。將Cu-In-Se@MSN固體粉末存放在冰箱中，在不需要進一步保護的情況下，可以穩(wěn)定幾個月。上述數據揭示了Cu-In-Se@MSN在不同環(huán)境中的長期光穩(wěn)定性。在熒光性質方面，我們以Cu-In-Se@MSN為例，說明了Cu-In-Se量子點的組裝越致密、越穩(wěn)定，其發(fā)光強度越強，發(fā)光壽命越長。

圖5：注射不同Cu-In-Se@MSN探針對正常裸鼠血管成像的比較。A)尾靜脈注射成像探針示意圖B)脈注射Cu-In-Se@MSN-2探針C)靜脈注射Cu-In-Se@MSN-1探針的NIR-II顯像D)注射Cu-In-Se@MSN-2探針24小時后的裸鼠高倍率NIR-II血管成像(E)在(D)高倍率血管圖像中沿著白虛線的代表性的PL橫截面強度分布。高斯擬合配置文件以紅線顯示。

最后，在上述Cu-In-Se@MSN探針體外NIR-II成像的鼓舞下，進一步驗證了它們在活體成像中的應用。將壽命較長的Cu-In-Se@MSn-2探針和壽命較短的Cu-In-Se@MSn-1作為對照探針分別靜脈注射到正常裸鼠(n=3)體內，注射劑量為20 mg kg−1(圖5a)。然后在選定的時間點收集連續(xù)的全身NIR-II圖像。如圖5b所示，在注射Cuin-Se@MSN-2探針后2小時，可以識別腹部區(qū)域的血管結構，并且隨著時間的推移背景保持干凈，可以明顯地看到腹部的血管結構。相反，當使用Cu-In-Se@MSN-1作為對照探針時(圖5c)，整個身體(如肝臟、心臟、腎臟和腸道)都有明顯的背景噪聲干擾，幾乎看不到血管結構。隨后進行了高倍率的NIR-II成像，以可視化血管結構(圖5d)。顯然，腹部區(qū)域可見具有高階分支的小血管(如圖5d的插圖所示)，表明Cu-In-Se@MSN-2探針用于血管成像的空間分辨率很高。相應的血管橫截面強度曲線以尖銳的峰值為特征(圖5e)。通過計算截面強度分布的高斯擬合半高寬(FWHM)進一步測量血管直徑。所選腹部血管的半高寬值分別為≈123和101µm。因此，用Cu-In-Se@MSN-2作為活體成像探針可以更準確、實時地確定血管的較小分支和高階分支。

參考文獻

Chang,B., Zhu, H., Wu, Y., Wu, S., Zhang, L., Qu, C., Ren, Y., Cheng, Z.,Aggregation-Induced Phosphorescent Imaging in the Second Near-Infrared Window.Adv. Optical Mater. 2021, 2101382.

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