單細胞技術在癌癥免疫治療中的應用
現有的，最常見的可用于腫瘤免疫治療研究的單細胞技術包括用于轉錄分析的單細胞RNA測序（scRNA-seq）、用于蛋白質組學分析的質譜流式細胞術（CyTOF）和空間檢測技術。這些技術提供了細胞的分子圖譜，將細胞分為不同的細胞群，實現細胞類型注釋，推測細胞狀態轉換以及關聯的分子通路。以此，我們可以確定驅動每種不同細胞類型行為的途徑，并推斷與細胞狀態變化相關的細胞內和細胞間相互作用。這些途徑的推論被廣泛用于當前腫瘤免疫學的臨床研究。目前正在開發的精準醫學策略是通過聯合療法重塑TME以提高免疫治療敏感性。這個過程中，單細胞方法有望助力精準免疫治療。
目前可用于了解腫瘤的細胞組成和細胞間相互作用的幾種方法包括：
1、 單細胞蛋白質組學 (CyTOF) 提供細胞組成和細胞狀態信息。
2、單細胞轉錄組學可提供與（A）相同的分析，也可以提供細胞軌跡預測以及T細胞和B細胞免疫組庫信息。空間技術能將細胞組成、狀態、細胞相互作用相關聯。
3、借助空間蛋白質組學及其單細胞分辨率，可以識別單個細胞類型并確定特定的細胞間相互作用。
4、空間轉錄組學雖然缺乏單細胞分辨率，但可以根據不同臨近細胞之間受體和配體的分子表達預測細胞相互作用，并發現不同細胞壁龕之間的致癌途徑。
圖1：癌癥分析的單細胞轉錄組學和蛋白質組學方法
在這個過程中，樣本制備及數據分析是最重要的環節，基于腫瘤研究常見的流程和注意事項如下：
樣本制備
大多數非空間單細胞技術，如scRNA-seq和CyTOF，需要解離并獲得活細胞進行分析（圖1A和1B）。最常用的樣品分離方法是酶消化。分離前的樣品儲存、酶的類型和孵育時間都會影響單細胞分析結果，因此必須針對每種腫瘤類型仔細優化。而空間檢測技術是基于玻片開發的技術，該技術保留了組織結構，無需進行解離。空間蛋白質組可以對冷凍和福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）樣品進行檢測（圖1C）。當前的空間轉錄組測序方法依賴于冷凍樣本，使用FFPE樣本的方法正在開發中（圖1D，目前10X Genomics公司剛剛推出針對FFPE樣品的空間轉錄組技術）。對FFPE保存樣品進行檢測使得對處理后并長期儲存的樣品進行回顧性臨床研究成為了可能。
數據分析
1、高通量單細胞或者空間組學數據分析的常規流程如下：
2、 單細胞和空間數據分析將從原始數據預處理開始，以去除質量差的細胞和數據；批量校正以消除由于實驗差異導致的樣品間誤差；數據填充以糾正實際數據缺失。
3、降維并使用聚類工具進行數據可視化和細胞類型注釋，這些工具根據每個細胞群表達的特定marker進行注釋。從這里開始，數據準備好進行下游分析，具體取決于應用的方法和生物學問題。
4、可以使用差異表達分析來識別分子改變。在轉錄組學數據中，還可以進行通路分析以確定癌癥進展的驅動因素和對治療的反應，以及預測細胞命運軌跡以了解腫瘤和 TME隨時間的調節。
6、最后，通過多組學方法對相同樣本的蛋白質和基因表達分析 或T細胞和B細胞免疫組庫分析與轉錄分析相結合，可增加細胞類型注釋的準確性并研究它們在癌癥演變和治療反應中的作用。
圖2：單細胞和空間分析的數據分析流程和方法
單細胞和空間檢測技術以及對應的數據分析流程作為癌癥研究的工具正在迅速發展，分析方法的進步將在挖掘新發現方面發揮作用。但是，機制的驗證實驗仍然是將單細胞研究轉化為可操作的治療靶點的重要補充。
在轉化免疫治療研究中，對機制的最終檢驗是驗證治療干預對患者腫瘤內的TME的免疫調節。雖然可以應用單細胞技術來檢測這些影響，但完整的機制研究需要時間進程分析，這將涉及從同一患者收集連續樣本，但這是不可行的。雖然監測患者外周血的免疫細胞組庫對于時間進程研究更可行，但比較腫瘤和外周血免疫細胞組成的單細胞研究已經發現了內在差異。因此，未來的研究需要提供腫瘤免疫和外周免疫圖譜之間的更全面的比較，以便能夠使用單細胞技術來鑒定治療性生物標志物。
患者腫瘤之間的異質性以及無法在患者中測試多種治療方案進一步挑戰了轉化研究中的單細胞機制研究。匯集臨床試驗研究和來自臨床前模型的干擾研究的單細胞圖譜可以為這類研究提供重要參考。用免疫療法治療的臨床前模型的單細胞分析可以發現與治療反應相關的細胞類型和通路，而對用相同療法治療的樣本進行跨物種分析可以揭示哪些治療反應是保守的。從單細胞數據集中比較小鼠和人類保守反應的新分析工具可以進一步支持臨床前分析的模型選擇，為臨床試驗的設計提供信息。
圖3：從小鼠到人體的高維分析研究將推動下一代精準癌癥免疫療法
技術的巨大成本給單細胞圖譜研究帶來了限制。因此，平衡好在隊列樣品中用蛋白質組學技術進行低維分析和利用選定的樣本進行高維機制研究是實驗設計關鍵的一步。在這些混合設計中，跨平臺數據集成的計算算法可以提供重要的補充以平衡分子深度和樣本量。實驗、計算和統計之間的密切合作可以支持優化研究設計，也可以根據每個項目的轉化研究目標優先考慮新的計算方法進行數據分析。多學科整合將幫助腫瘤研究領域克服這些挑戰，并利用單細胞和空間平臺在腫瘤免疫治療方面取得新發現。
總體而言，技術的發展為癌癥的理解和攻克提供了新的平臺和手段。雖然發展是循序漸進，很多問題也是隨著研究的深入一步步解決和出現新的問題，但我們也可以看到，現有的單細胞技術與空間技術已經讓我們對癌癥的真相和精準治療的目標越來越接近，相信在接下來的時間里，科學家們會給我們帶來更多驚喜。
參考文獻來源：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2021.07.004
