玩轉10x之一：
scifi-RNA-seq 借助ATAC試劑盒實現
超高通量單細胞表達譜測序ifi-RNA

       奧地利科學院分子醫學研究中心 (CeMM) 的研究人員開發了一種新的單細胞樣品制備方法，single-cell combinatorial fluidic indexing (Scifi)，可將基于10x Chromium Controller平臺單細胞RNA-seq的細胞通量提高15倍，這一成果發表在5月31日出版的Nature Methods上。
       在常規基于微滴的 scRNA-seq 中，進入到同一微滴中的兩個細胞將使用相同的細胞標簽標記它們的轉錄組，在數據分析過程中，這兩個細胞的轉錄組數據將無法區分，從而產生了有偏差的結果。為了最大限度地減少雙細胞微滴的比例，需控制上樣細胞數，使得兩個細胞不太可能進入同一個油包水微滴，大部分的微滴中僅含有Gel bead而不包含細胞。
       為提高油包水微滴的使用效率、釋放其高通量分析的全部潛力，作者在scifi-RNA-seq方法中，首先透化處理細胞或細胞核，將它們的轉錄組通過split pools方法在384孔板里反轉錄，加上預索引標簽，隨后包含預索引標簽cDNA的細胞或細胞核被匯集起來，10x上機制備油包水，生成的大多數微滴包有多個細胞或細胞核。應用10x scATAC Gel bead kit，在油包水內部cDNA又被標上10x cell barcode。雖然這兩輪加的標簽都不是單個細胞獨有的，而是相應獨立反應體系中的所有細胞共享的，但細胞或細胞核在兩輪標簽之間隨機混合，兩種標簽的組合能夠唯一地識別單個細胞。

•  經透化處理的細胞或細胞核微孔板里進行反轉錄，并加上孔位特異性的第一輪標簽

• 細胞帶著加標簽的cDNA進行10x上機，每個油包水里有1個Gel bead和多個細胞

• 細胞在油包水中裂解

• cDNA通過等溫連接加上第二輪即Gel bead上的10x barcode標簽

• 通過識別兩輪標簽組合拆分單細胞數據

       scifi 方法在概念上不同于cell hashing，cell hashing標簽區別的是各個樣品，而scifi基于全轉錄組預索引標簽，可以將轉錄本從超量上樣的油包水中溯源為各自的單細胞轉錄組。另外，scifi在可操作性上優于傳統的多輪組合標簽的方法，多輪組合標簽實驗流程繁瑣，且每個細胞的轉錄組復雜性較低。Scifi將微孔板和微流控組合，在 Chromium Controller系統的每個通道可獲得多達 150,000個單細胞轉錄組，每張芯片100 萬個單細胞轉錄組，且每個細胞能夠獲得高復雜性的轉錄組數據。作者用多種細胞系以及原代細胞進行了方法學驗證。作者推測scifi-RNA-seq 最可能立即用于兩個領域：追求復雜組織、器官或整個生物體的單細胞表征的細胞圖譜項目，以及高通量擾動研究，包括藥物篩選和單細胞 CRISPR 篩選。

滴~EMTD溫馨提示

       目前此方法仍處于學術研究、實驗室研發范疇，未達到經反復檢驗的商業化應用階段。10x 目前已推出超高通量的Chromium X及試劑 ，結合CellPlex 試劑盒，單張芯片通量可達到百萬細胞級別。
 

玩轉10x之二：
ASAP-seq, Dogma-seq單細胞DNA/RNA/Protein
中心法則三要素一網打盡

       美國紐約基因組中心的研究人員開發了兩種單細胞多組學檢測方法，一種是借助10x scATAC試劑盒，在單細胞水平同時檢測染色質可及性、蛋白水平和線粒體DNA，命名為ASAP-seq (ATAC with select antigen profiling)。在文章的審稿過程中，10x推出了GEX+ATAC的單細胞多組學試劑盒，作者在此基礎上又開發了一種新方法Dogma-seq，實現單細胞同時檢測染色質可及性、mRNA表達、蛋白水平和線粒體DNA克隆追蹤四重信息。這一成果發表在6月3日出版的Nature Biotechnology上。
       常規做ATAC-seq通常要盡量減少線粒體DNA的干擾，但作者認為如果能夠富集獲得高覆蓋度的線粒體信息，就可以通過線粒體基因組攜帶的突變進行追蹤，以研究細胞間的相互關系。作者又基于CITE-seq技術還開發了一套bridge oligos，使得帶oligo標簽的抗體檢測可以整合到ATAC-seq的流程中。

       上圖詳解了ASAP-seq如何將蛋白檢測整合進scATAC-seq的工作流程。a.細胞樣品前處理用連有oligo的抗體染色，而后對細胞進行固定、透化處理、Tn5酶專座。b.在油包水微滴內，抗體標簽結合外加的bridge oligos并以其為模板延伸，延伸后可以同Gel beads上的oligo互補，后續抗體標簽和ATAC酶切下來的DNA片段均被加上細胞Barcode。
      作者進一步將蛋白檢測推進到細胞內蛋白水平，ASAP-seq的細胞固定后透化處理步驟有可能用于檢測胞內蛋白，而這在高通量的scRNA-seq中是無法做到的。作者用不同接頭的抗體標簽以區別胞內和細胞表面蛋白，用細胞表面蛋白TSA TBNK panel和3種TSB胞內蛋白抗體染色PBMC，在根據單細胞ATACT結果分群的圖中，蛋白marker的分布與先驗知識以及基因活性值是一致的。

       上圖展示了ASAP-seq檢測細胞表面及胞內蛋白的實驗設計和結果。a.PBMC先染細胞表面的TSA TBNK Panel，進行細胞固定和透化，而后染TSB胞內的蛋白。b.PBMC根據ATAC結果分群，將主要的外周血細胞類型進行了注釋。c和d分別顯示了細胞表面和胞內蛋白細胞分布。         Dogma-seq借助10x的多組學試劑，蛋白檢測應用帶Poly A的Total-seq A抗體標簽，可以和多組學Gel bead上的oligo T互補。作者測試了LLL和DIG不同的細胞透化方法，LLL是指使用0.1% PFA / 0.1% NP40，DIG方法為使用0.01% Digitonin，結果顯示LLL可得到更多更完整的線粒體DNA信息用于追蹤，而DIG方法可以更好地檢測細胞表面蛋白。