來(lái)自斯坦福大學(xué)、陳-扎克伯格生物中心以及加州大學(xué)舊金山分校的研究人員建立了一個(gè)名為T(mén)abula Muris的開(kāi)源數(shù)據(jù)庫(kù)，收錄了小鼠的多個(gè)細(xì)胞類(lèi)型及其基因表達(dá)數(shù)據(jù)。這項(xiàng)成果發(fā)表在《Nature》雜志上。研究團(tuán)隊(duì)利用流式分選(FACS)方法和微流體液滴捕獲(droplet)方法，從小鼠20個(gè)不同器官中分離出超過(guò)10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并開(kāi)展單細(xì)胞RNA測(cè)序。這些數(shù)據(jù)讓人們能夠比較各個(gè)細(xì)胞類(lèi)型和組織間的基因表達(dá)，從而更深入地了解細(xì)胞多樣性。
 

 
實(shí)驗(yàn)方法
小鼠組織和器官來(lái)源：
主動(dòng)脈、膀胱、骨髓、大腦、膈肌、脂肪、心臟、腎臟、大腸、四肢肌肉、肝臟、肺、乳腺、胰腺、皮膚、脾臟、胸腺、舌頭和氣管等。
 
數(shù)據(jù)來(lái)源于兩種不同單細(xì)胞測(cè)序方法：
•  10X: 細(xì)胞個(gè)數(shù)n=55656 基于油包水微流控(droplet)技術(shù)的3’端測(cè)序：能夠在相對(duì)低的覆蓋率下對(duì)相應(yīng)器官來(lái)源的數(shù)千個(gè)細(xì)胞完成高細(xì)胞通量的檢測(cè)。
•  Smart-seq2: 細(xì)胞個(gè)數(shù)n=44949 基于流式分選(FACS) plate-based的RNA全長(zhǎng)測(cè)序：提供靈敏度和覆蓋度更高數(shù)據(jù)。
 
該研究中基于FACS的SMART-seq2單細(xì)胞測(cè)序流程中，cDNA合成擴(kuò)增、文庫(kù)制備和文庫(kù)pooling分別使用了SPT Labtech的dragonfly discovery、mosquito  LV genomics以及mosquito X1進(jìn)行移液操作。

High-throughput Smart-seq at CZ Biohub：陳-扎克伯格生物中心的高通量Smart-seq單細(xì)胞測(cè)序流程，每天可處理約8萬(wàn)個(gè)細(xì)胞
 
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
對(duì)不同器官組織來(lái)源的細(xì)胞進(jìn)行分類(lèi)，利用t-SNE算法來(lái)觀察各器官的不同細(xì)胞類(lèi)型之間的關(guān)系。 t-SNE visualization of all FACS cells：t-SNE plot of all cells collected by FACS, coloured by organ, overlaid with the predominant cell type composing each cluster; n = 44,949 individual cells.
 
對(duì)不同的單細(xì)胞測(cè)序方法進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同的器官類(lèi)型中FACS法檢測(cè)到的基因數(shù)量最多，幾乎是droplet的兩倍。 Methodological comparison of detected genes and library saturation： The number of genes detected (threshold of >0 reads or UMIs per cell) by FACS (red; n = 21,105 individual cells), microfluidic-droplet (green; n = 55,032 individual cells) and microwell-seq (blue; n = 25,891 individual cells) methods
 
總結(jié)
在單細(xì)胞研究中， 利用高通量的10X與高靈敏度的Smart-seq2相結(jié)合，對(duì)于不同的研究方向具有互補(bǔ)性的優(yōu)勢(shì)：
•  基于droplet技術(shù)的優(yōu)勢(shì)是測(cè)的細(xì)胞數(shù)量多能夠發(fā)現(xiàn)稀少的細(xì)胞和細(xì)胞狀態(tài)。
•  基于FACS方法的特點(diǎn)是測(cè)的細(xì)胞數(shù)量少但是覆蓋度高、能夠富集特定的細(xì)胞，可用于研究微異質(zhì)性（包括低表達(dá)基因，可變剪接，序列變異分析）。
 
對(duì)于基于FACS的Smart-seq2單細(xì)胞測(cè)序，往往具有一些難點(diǎn)：
1. 單細(xì)胞建庫(kù)試劑的成本昂貴
2. 需要對(duì)每個(gè)細(xì)胞單獨(dú)建庫(kù)，操作繁瑣，難以上量
 
而來(lái)自SPT Labtech最新的液體處理技術(shù)，可以將基于FACS的單細(xì)胞測(cè)序，往更低成本、更高通量、更自動(dòng)化的方向建設(shè)工作流程。 在陳-扎克伯格生物中心的高通量Smart-seq單細(xì)胞測(cè)序流程中，通過(guò)SPT Labtech的dragonfly discovery和mosquito  LV genomics進(jìn)行總體系2.5μL的單細(xì)胞cDNA合成和3.6μL的文庫(kù)構(gòu)建，節(jié)省了10倍的試劑成本，并且每天可以處理20塊384孔板，也就是約8萬(wàn)個(gè)樣本。
 
參考文獻(xiàn)：
Consortium, T. M. , et al. "Single-cell transcriptomics of 20 mouse organs creates a Tabula Muris." Nature 2018.