人類DNA中HPV16和HPV18的靈敏度和特異性檢測
 

全世界有超過5％的癌癥是因人乳頭瘤病毒（HPV）導致的，它主要通過性傳播的方式感染[1]。十多種HPV亞型由于其在細胞轉化中的作用以及宮頸癌和口咽癌發病率的增加而被認為是高風險的。在這些亞型中，HPV16和HPV18是最普遍的，在大約70％的宮頸癌和90％的口咽癌中均能檢測到[1]。HPV16和18通過將其病毒序列的片段（包括致癌的E6和E7區域）整合到細胞基因組中，從而使細胞永生并轉化。使用能夠區分高危型HPV和低危型HPV的靈敏而特異的分子技術，進行早期HPV檢測對于治療癌前病變和預防宮頸癌進展至關重要。在這里，我們展示了使用3色熒光通道Naica^TM自動化微滴芯片數字PCR系統上的檢測方法（表1）如何可靠地檢測和定量人類DNA樣品中的HPV16，HPV18和人類參考基因ALB（圖1）。
 

表1

使用優化的3色Naica^TM自動化微滴芯片數字PCR系統進行HPV分析，在僅包含人類野生型基因組DNA（最終濃度為400 cp /μL）的36個重復樣品中，未檢測到假陽性，空白限為0。在以人類野生型DNA（最終濃度為400 cp /μL）為背景下對合成的HPV16和HPV18 DNA進行系列稀釋，并進行了3次重復，結果檢測到HPV16和HPV18基因在95％的置信水平下，最終濃度降至每微升0.2個拷貝，突變等位基因頻率為0.05%（圖2）。
 

圖1

Crystal Miner軟件生成的3D點圖，圖中同時顯示檢測到的HPV16、HPV18和ALB參考基因。熒光基團名稱顯示在括號中。
 

3色Naica^TM自動化微滴芯片數字PCR系統檢測（A）HPV16和（B）HPV18靶標的線性和靈敏度。在400 cp/μL WT-DNA（10000拷貝/25μL反應）的背景下，對HPV16和HPV18的連續稀釋樣本進行了3次測定，稀釋范圍為20-0.2 cp/μL（500-5拷貝/25μL反應）。豎線表示95％置信區間下的濃度范圍。

患者樣本中穩健的HPV16和HPV18檢測
 

采用3色熒光通道Naica^TM自動化微滴芯片數字PCR系統技術，利用HPV試劑盒對4例口咽癌患者福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）腫瘤組織和4例非HPV感染的非小細胞肺癌（NSCLC）患者FFPE組織中提取的DNA進行分析（表2）。口咽部FFPE樣本先前使用實時熒光定量PCR進行了檢測[2]。采用3色Naica^TM自動化微滴芯片數字PCR系統檢測的4份HPV16和HPV18樣本均為陽性，非HPV樣本檢測結果為陰性。
 

表2

癌癥患者FFPE DNA樣本中HPV16和HPV18的定量。結果以sapphire芯片中的每微升拷貝數（最終濃度）給出。

應用說明亮點
 

♦ 3色熒光通道Naica^TM自動化微滴芯片數字PCR系統能夠同時檢測和定量HPV16和HPV18以及人類參考基因ALB。

♦ 在每25μL反應10000個拷貝的野生型DNA背景下，盡管突變等位基因的頻率為0.05%，HPV16和HPV18依然能夠精準的被檢測到，并且在95%的置信區間內沒有檢測到假陽性。

♦ 在連續稀釋實驗中，3色HPV檢測顯示預期和測量的HPV16和HPV18濃度之間存在良好的相關性。

♦ 3色熒光通道Naica^TM自動化微滴芯片數字PCR系統成功地檢測出口咽癌患者FFPE腫瘤標本DNA中HPV16和HPV18。