上一講中我們已經了解到單細胞測序的重要性及應用方向。

而單細胞測序日趨火爆的原因很大程度上得益于單細胞分離技術的不斷完善。這一講，我們將跟大家一起回顧傳統的單細胞分離技術，并重點介紹單細胞分離技術的新寵微孔芯片技術及微流控技術。圖1為目前常見單細胞分離設備。

圖1：目前常見單細胞分離設備

傳統單細胞分離技術

相信許多實驗人員，都見過下面我們要介紹的傳統的單細胞分離設備。傳統的單細胞分離方法主要有：口吸管技術、顯微操作法、激光顯微切割法及流式細胞法。

利用口吸管技術，操作者可以在顯微鏡下選擇形態較好的細胞，對細胞幾乎無損傷，因此下游實驗的成功率非常高，但對操作人員的熟練度要求較高，見圖2。

圖2：顯微鏡下采集單細胞

手工操作分離單細胞費時費力。而顯微操作儀的發明解放了人手，使得整個操作過程更加簡單可控。利用顯微操作儀，見圖3，操作者可以通過手動或者自動化的辦法實現單細胞獲取。與口吸管相比，顯微操作的優勢在于能夠通過儀器準確地控制單細胞的吸取與釋放，因此對操作人員自身的技術要求降低。

圖3：Eppendorf顯微操作儀

利用激光顯微切割儀，見圖4，操作者可以將組織內單一細胞或細胞群切割下來進行研究，避免間質細胞及一些炎癥細胞造成背景“污染”，可以了解到細胞的位置信息。但該方法相鄰細胞容易污染，另外在組織固定及激光切割的過程中可能會破壞細胞的完整性，對細胞核酸損傷較大，從而影響后續的遺傳物質的擴增。

圖4：ArcturusXT^TM激光顯微切割儀

流式細胞儀，原理見圖5，能夠對鞘液包裹著的單細胞實現散射光及熒光的檢測。分選型的流式細胞儀通過對鞘液施加超高速震動使液流形成液滴，并進行瞬時充電。包裹單細胞的帶電液滴經過高壓電場后發生偏轉，進入收集裝置中，從而實現細胞的分離。

流式細胞儀技術能夠很好的實現大量細胞及復雜樣本的分選，并且能夠做到精度高、通量較大（96或384）。但是流式機械剪切力比較大，影響細胞活性，同時要求的細胞數量多，對于一些無法獲取足夠數目細胞的項目來說是不適用的。

圖5：流式細胞分選儀分選原理

以上傳統的單細胞分離技術可以幫助研究者獲取單個細胞，但并不能同時做到下游的擴增。需要操作者對分離到單個PCR管中的細胞進行后續的裂解、擴增及建庫，仍然需要繁瑣的操作。因此我們下面將重點介紹新型的高通量單細胞分離技術－微孔芯片技術及微流控技術。

新型高通量單細胞分離技術

目前新型高通量單細胞分離技術主要有微孔芯片技術及微流控技術。

微孔芯片技術是指通過制作個孔徑略大于細胞直徑的微孔陣列，通過重力、流體、電場等方式將細胞懸液中的單細胞分離至微孔中的技術。
 
目前隸屬于Takara Bio的WaferGen生物系統公司于2014年推出了ICELL8^TM Single-Cell System（圖6），通過MultiSample NanoDispenser（MSND）能夠準確的對ICELL8芯片上搭載的5184個微孔進行分注。成像階段可以得到各個微孔的圖像，結合專用軟件CellSelect自動選擇單細胞進行后續的實驗。

圖6：ICELL8^TM Single-Cell System成像分析

Alex K. Shalek等開發了便攜式單細胞分離技術可以快速和低成本地進行單細胞RNA測序。他們設計了捕捉單個細胞的納米微孔陣列，見圖7，用有條形碼的磁珠捕獲RNA片段。僅需要移液槍即可實現單細胞的高通量分選。Seq-well過程能夠很好捕獲和分析序列約每個細胞10至15%的RNA轉錄本。

圖7：Seq-well（Nature Methods 14, 395–398 (2017)）

微流控技術是指通過微米級別的流道精確操控微升、毫升級別樣品的技術，目前主要有微反應室、液滴技術。微流控技術在細胞分選應用方面優勢巨大，可利用重力離心、流體力學、電場力等來捕獲細胞，同時還可以將多種操作單元結合在一起，集細胞捕獲、細胞培養、細胞裂解及后續的檢測分析于一體，實現高通量、自動化、集成化。

微反應室（microchamber）

運用流體技術實現單細胞分選的商業化產品中較為有名的有Fluidigm 公司的C1 單細胞自動制備系統（圖8）。該系統基于Fluidigm創新的微流體技術，將溶液中的細胞樣品加在C1^TM微流體芯片上，快速自動分離出 96 或384個單細胞并分配到單個制備倉中；之后在芯片上進行細胞裂解、RNA反轉錄及預擴增。

圖8：Fluidigm 公司的C1 單細胞自動制備系統

液滴技術

圖9：液滴技術（Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug 25; 106(34): 14195–14200.）

液滴技術（圖9）是通過水溶液和油相從不同的微通道中流出并融合，形成一個“油包水”的乳液滴。將液滴技術運用到單細胞分離技術中即將單個細胞、反應試劑等通過微滴生成裝置包被在一個油滴中形成油包水的微反應體系。

目前市場代表產品主要有10x Genome公司的Chromium^TMController（見圖10）和Illumina聯合Bio-Rad推出的ddSEQ Single-Cell Isolator。這兩款單細胞分離儀器在設計原理上有一定的相似度，能在數分鐘內形成百萬個液滴，可以達到上萬個細胞同時分離、擴增，由于每個細胞攜帶不同的分子標簽進行區分，后續可以允許大量細胞同時在一個反應體系中擴增，因此通量很大同時消耗的試劑量低，最終折合到每個單細胞的費用低，成為目前單細胞轉錄組研究的明星產品。

圖10：10x Genome公司的Chromium^TMController

結束語

相信大家對單細胞分離技術已經有了初步的了解，最后我們也對目前的單細胞分離技術進行了一下總結比較。

單細胞分離技術總結如下表：

我們擁有的技術

華大作為一直在高通量測序研究領域走在前列的機構，多年來在單細胞分離中積累了豐富的經驗。目前已經擁有包括口吸法、 顯微操作、顯微切割、流式分離、ICELL8、Chromium^TM單細胞分離的多個低、高通量的分離平臺以及對應的后續擴增建庫解決方案。

參考文獻

[1] Hou, Y., Song, L., Zhu, P., Zhang, B., Tao, Y., Xu, X., Li, F., Wu, K., Liang, J., Shao, D., et al. (2012). Single-cell exome sequencing and monoclonal evolution of a JAK2-negative myeloproliferative neoplasm. Cell. 148, 873-885.
[2] Macosko, Evan , Basu, Anindita, Satija, & Rahul, et al. (2015). Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell, 161(5), 1202-14.
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