徠卡課堂 | LAS X功能冰山一角之FRET成像

隨著顯微成像技術(shù)的發(fā)展，科研工作者對(duì)成像分辨率的要求越來越高，為此Leica在最新一代SP8共聚焦顯微鏡的基礎(chǔ)上相繼推出了超高分辨的STED和高分辨的Hyvolution；另一方面，簡單的圖像采集和分辨率的提升已經(jīng)不能滿足很多科研工作者的需求，他們需要更高級(jí)更強(qiáng)大的成像功能與圖像處理功能。

LAS X軟件作為Leica顯微成像的搭載平臺(tái)，不僅能夠提供完美的成像質(zhì)量，而且整合了眾多高級(jí)應(yīng)用并具有強(qiáng)大的后期數(shù)據(jù)處理分析功能，包括圖像2D、3D測(cè)量與分析功能、FRAP功能、FRET功能、Hyvolution高分辨功能、活細(xì)胞記錄分析功能（live data mode）等，可根據(jù)用戶不同的需求提供靈活的成像方案。

接下來小編將以FRET為例介紹其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。

圖1 LAS X軟件強(qiáng)大的圖像后期處理及高級(jí)成像模塊。

FRET 簡介

FRET（Förster resonance energy transfer，熒光共振能量轉(zhuǎn)移）發(fā)生在供體熒光分子與受體熒光分子的距離足夠近且供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜相重疊時(shí)（10 nm以內(nèi)）。當(dāng)供體分子吸收一定頻率的光子后被激發(fā)到更高的電子能態(tài)，在該電子回到基態(tài)前，通過共振實(shí)現(xiàn)能量向鄰近受體分子轉(zhuǎn)移。發(fā)生FRET后，供體的熒光強(qiáng)度比它單獨(dú)存在時(shí)要低的多，而受體發(fā)射的熒光卻大大增強(qiáng)，同時(shí)供體的熒光壽命也會(huì)因FRET的發(fā)生而縮短（FLIM-FRET應(yīng)用）。

因此通過FRET可以分別從熒光強(qiáng)度及熒光壽命兩個(gè)維度檢測(cè)分子間的相互作用及分子的折疊與構(gòu)象變化。

圖2 FRET發(fā)生原理。

FRET 在生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用

1）2016年發(fā)表在nature communication上的文章“AFRET biosensor reveals spatiotemporal activation and functions of aurora kinaseA in living cells”通過FRET技術(shù)構(gòu)建了一種新型的生物敏感器（biosensor），通過該敏感器可以實(shí)現(xiàn)在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)Aurora kinase A蛋白時(shí)空調(diào)控及功能的研究。

首先，作者分別在體外和體內(nèi)借助FLIM-FRET及免疫印跡技術(shù)證明生物敏感器GFP-AURKA-mCherry能夠正確的反映Aurora kinase A的激活情況，且其發(fā)生FRET的條件即其構(gòu)象的改變是由其Thr288發(fā)生磷酸化導(dǎo)致的。通過定位及功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)，作者進(jìn)一步證明該生物敏感器能正確行使Aurora kinaseA的功能。

圖3 在體外通過FLIM-FRET技術(shù)驗(yàn)證GFP-AURKA-mCherry生物傳感器。

接下來通過該生物敏感器，作者成功實(shí)現(xiàn)了在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)Aurora kinaseA時(shí)空激活調(diào)控的觀察，證明其在G1時(shí)期被激活，并通過TPX2和CEP192蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)微管的穩(wěn)定性。

圖4 TPX2和CEP192在G1時(shí)期激活GFP-AURKA-mCherry。

Aurora kinase A是公認(rèn)的治療癌癥的藥物作用靶點(diǎn)，由于其表達(dá)量低，在活細(xì)胞內(nèi)對(duì)其進(jìn)行跟蹤研究非常困難。該生物敏感器基于FRET技術(shù)構(gòu)建，通過FLIM-FRET技術(shù)可成功實(shí)現(xiàn)在低表達(dá)量的條件下對(duì)Aurora kinase A展開研究，因此該生物敏感器對(duì)于針對(duì)Aurora kinase A的信號(hào)通路研究及癌癥藥物篩選具有重要意義。

2）另一篇發(fā)表在oncotarget上的文章“HER2-HER3 dimer quantification by FLIM-FRET predicts breast cancer metastaticrelapse independently of HER2 IHC status”利用了FLIM-FRET技術(shù)檢測(cè)乳腺癌病人中HER2-HER3二聚體的水平。HER2表達(dá)水平升高是乳腺癌診斷中的一個(gè)重要指標(biāo)，然而并不能用來檢測(cè)僅由HER2-HER3二聚體升高引起的乳腺癌，因此急需新的檢測(cè)方法。本文章基于FLIM-FRET技術(shù)順利實(shí)現(xiàn)了對(duì)HER2-HER3二聚體水平的檢測(cè)，因而成為檢測(cè)由HER2-HER3升高引起的乳腺癌的一個(gè)新型診斷方法，對(duì)乳腺癌發(fā)生及愈后診斷具有重要意義。

圖5 通過FLIM-FRET技術(shù)檢測(cè)HER2-HER3二聚體水平。

小結(jié)

LAS X軟件中提供了專門的FRET技術(shù)操作向?qū)В�可分別通過FRET-AB（acceptor photo-bleaching）和FRET-SE（sensitizedemission）兩種方法對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，用戶只需根據(jù)操作向?qū)б徊讲讲僮骶涂奢p松得到樣本的FRET數(shù)據(jù)。

圖6 LAS X軟件中的FRET操作向?qū)А?/STRONG>