牙齒正畸移動模型大鼠三叉神經節內 P2Y2和P2Y6的表達變化

【摘 要 】 目的：研究大鼠牙齒正畸移動模型下，三 叉 神經節（trigeminal ganglion,  TG) 內嘌呤受體P2Y2 和 P2Y6 的表達變化，以探討P2Y2 和 P2Y6 受體在正畸牙齒移動所致疼痛機制中的作用。方法：4 2 只 雄 性 SD 大鼠隨機分為對照組和實驗組，實驗組再按加力后12h 、ld 、2d 、3d 、5d 、7d不同時間段分為6 個亞組，每組 6 只。實驗組模型大鼠以80 g 力作用于大鼠上頜左側第一磨牙，模擬臨床矯治的牙移動過程。之后在不同時間點采用曠場實 驗和試嘴行為檢測大鼠發生疼痛的行為學表現，利用Western Blot方法檢測T G 內 P2Y2、P2Y6 的表達變化，并分析其與疼痛發生的相關性。結果：模型建立后，曠場實驗檢測到一定的規律：即實驗組大鼠前30s 通過的總線數、 5min內通過的總線數、5min內通過曠野中心的總線數、5m in內抬起行為的總次數這四組參數從12h開始下降， 2d降至最低,后逐漸上升至7d與對照組基本一致。5min內拭嘴行為的總時間自12h開始增高,2d升至高峰， 后逐漸下降至7d與對照組基本一致。Western  Blot檢測結果顯示:T G 內 P2Y2 和P2Y6蛋白的表達量自實驗后12h開始逐漸升高至2 d 達到高峰，7 d 后下降至對照組水平。與對照組對比，1d、2 d 、3 d 組均有顯著性差異（P <0.05) 結論：在大鼠牙移動過程中，T G 內 P2Y2 和 P2Y6 的表達變化呈現短時程的上調規律，推測P2Y2和P2Y6與牙移動后的痛行為學表現密切相關。

【關鍵詞】正畸牙移動;三叉神經節;疼痛；P2Y2; P2Y6; 大鼠

疼痛是正畸治療中常見的也是令正畸醫生棘手的問題之一 m ，探討口腔正畸疼痛的發生機制以及 尋求減輕或消除疼痛的方法是目前國內外正畸領域 的研究熱點之一。三 叉 神 經 節 （trigem inal  ganglion, TG) 是外周感覺信息傳人中樞的初級感覺神經節， 是感受頜面部傷害性刺激的重要結構，在其神經元上的一些核苷酸受體，可介導頜面部的傷害性感覺。三憐酸核昔（adenosine triphosphate，ATP) 已被發現作為信號分子在神經系統和神經膠質細胞中起著中介作用，ATP通過激活P2受體會產生一系列生理效應。P2 受 體 包 括 P2X ( 配體門控非選擇性陽離子通道受體）和 P2Y( G 蛋白偶聯受體）兩大類。 現已發現了P丨3  ,4, 8 種P2Y 受體亞型 。 W eick等研究發現P2Y2受體表達于大鼠的TG神經元 內。在受損的TG神經元內可觀察到P2Y 受體的表達量明顯增多，提示三叉神經痛可能與P2Y 受體的表達有關。本研究擬通過大鼠牙齒正畸過程 中疼痛的產生與T G 內 P2Y2 和 P2Y, 表達變化的相關性分析來探討正畸牙齒移動過程中疼痛發生的外周機制，為進一步研究P2Y2和P2Y6 受體在正畸疼痛機制中的作用奠定基礎，也為研發新型的 頌面部鎮痛藥物提供理論依據。

材料和方法

1 材料

1 . 1 實驗動物及分組選8周齡雄性S D大鼠共42只（第四軍醫大學實驗動物中心提供，所有實驗動物符合國際實驗動物要求），體 重 200 ~ 250 g , 在安靜環境中飼養48h以上。隨機分為對照組和實驗組 ，實驗組按加力后12h 、ld 、2d 、3d 、5d 、7d 不同時間段又分為6 個亞組，每 組 6 只 。1 - 2 模型建立采用7 % 水合氯醛 （0.4  ml/100g ) 腹腔注射麻醉大鼠，之后在上頜左側第一磨牙的牙頸部 、前牙唇面及軸角處磨出深約〇.2m m的固位溝 。將大鼠上頜左側第一磨牙和前牙間用0.02mm 結扎絲拴正畸 用 N i Ti螺 旋 彈 簧 （0.01  inch) 。為防止彈簧脫落，用樹 脂釉質粘結劑將固位溝內的結扎絲進一步固定。測力計測力 ，建 立 80g 正畸力作用下的牙齒移動模型。整個實驗過程中忽略支抗的喪 失 ，實現以上領2 個中切牙為支抗，拉左側第一磨牙向近中移動，實驗組分別于加力后丨2  h 、l  d 、2  d 、 3  d 、5  d 、7  d 六個時間點處死動物，對照組大鼠于7 cl處死 ，之后迅速取實驗組和對照組左側三叉神經節。

2 方法

2 . 1 疼痛行為學檢測

2 . 1 . 1 曠場實驗將大鼠置于箱中（由上海欣軟信息科技有限公司提供）， 每次1只。每 次均從箱子的右角開始 ，分別觀察各組大鼠的行為學表現，同時記 錄以下參數 ：每只大鼠前30S通過的總線數、5min內通過的總線數、5min內通過曠野中心的總線數 、5min內抬起行為的總次數。注意當大鼠4只爪子完全通過時才記為1條線。

2.1.2 拭嘴行為實驗將實驗大鼠放到箱中，每次一只，每只觀察5  min, 用錄像機分別記錄對照組及實驗組大鼠模型建立后 12h 、l  d 、2d 、3d 、5d 、7d 拭嘴行為反應 ，請未參加實驗的觀察者統 計5min 內大鼠拭嘴行為的總時間。

2.1.3 Western Blot檢測 P2Y2和P2Y6受體的表達變化腹膜腔注射 7%水合氯醛（280mg/ kg) ，深麻醉后將大鼠開胸，用〇.01tnol/ L 的 PB S溶液迅速沖去血液 、并于冰上快速取出左側TG，然后置人裝有蛋白酶抑制劑（PM SF)及組織裂解液（RIPA) 的EP 管 內 ，將 E P 管放于冰上使用超聲裂解儀充分勻漿組織 。充分勻裝后 12000  r/ m i n j T 離心15min。將上清液移人新的 1.5 mlEP 管內 ，用BCA 法進行蛋白定量，確定含10 |x g 及以上的蛋白 上 樣體積 。蛋白樣品采用1 0 % 的SD S -P A G E 進行電泳分離 ，加人預染蛋白 markei•，根據預染marker的位置確定所需蛋白 P2Y2 、P2Y6 及 p -a c tin 的位置，將膠上蛋白電轉到 P V D F膜上做免疫雜交反應（P V D F 膜預先用甲醇溶 液 浸 泡 I  m in激活 ）。用 含 5 % 脫脂奶粉封閉2  h , 分別加入兔抗  P2Y2  Ig G( 1:200; Alomone  Labs . Jeru­salem)  ' 兔抗 P2Y6  Ig G( 1 : 200; Alonione  Lahs’Jerusa- lem ) ，4 t 孵 育 過 夜 后 使 用 TBS-T 洗 膜 10  min  x 3 次 ，加 人 H R P 結 合 的 驢 抗 兔 Ig G(  l : 5〇00;中杉，北京 ），室 溫 下孵育1  h ; TBS-T 洗 膜 10  min x 3 次后，在Bk>-Racl成像系統中滴加化學發光液進行熒光條帶掃 描 ，Image  L a b 軟 件 分 析 熒 光 密 度 值 。依次使用 Stripping  Buffer 洗膜 30  m in、PBS 洗膜 10  min X 2 次 、 TBS-T 洗 膜 5  m in后 ，用 含 5 % 脫脂奶粉封閉2  h ，加人小鼠抗 P-a(‘tin  Ig G ( 1: 5000 ; Sigma, Germany) ，4 °C 孵育過夜后使用 TBS-T洗膜10 min x 3 次 ，加人H R P結合的驢抗小鼠 Ig G( l :5 0 0 0 ;中杉，北 京 ），室溫下孵育1 h ;TBS-T洗膜 10  min  x 3 次 后 ，在 Bio- Rad 成 像系統 中滴加 化學發 光液進 行熒光 條帶掃描 , Im age L ab軟件分析熒光密度值。以 P2Y2、P2Y6 及 p -actin 的熒光密度值之比計算出各實驗組大鼠與對照組大鼠的相對蛋白表達量。統計 學處理 ：使用 SPSS19. 0 軟件進行統計分析 ，用 《檢驗比較對照組與實驗組的行為學指標及P2Y2 與 P2Y6的表達差異 ，數據用均數±標準差 ( x ± s ) 表示 ，采用單因素方差分析進行組間差異的比較，以P <0.05表示差異有統計學意義。

討  論

疼痛是正畸治療過程中的一個常見反應 ，與其他急性損傷相比 ，正畸治療中產生的疼痛具有周期短和強度低的特點。正畸疼痛不僅是一個復雜的生理問題 ，它還是一個心理的行為問題，影響正畸疼痛的因素有很多，包括醫源性因素和個體因素 。醫源性因素是指臨床中使用不同的矯治方法 、不同的矯治器 、不同類型的弓絲等，都會對正畸疼痛產生不同的影響；而個體因素包括患者的年齡、性 別 、心理 、情緒 、注意力和遺傳等諸多因素, 還有研究表明人們對疼痛的反應也會受到不同社會文化背景的影響。不同國家的正畸醫生曾對于正畸過程中是否存在疼痛以及正畸疼痛與上述因素的相關性等問題進行過研究 ，但這些研究均來自于臨床 ，患者的主觀 感受多 ,影響因素頗復雜，結論亦不盡相同。因此 ，本研究試圖通過動物實驗進一步研究P2Y ，和 P2Y6受體在正畸疼痛及頜面部疼痛機制中的作用。

牙齒正畸移動模型建立后，實驗組大鼠表現出明顯的應激水平降低和試嘴行為的增多 ，后逐漸恢復至對照組水平 。此趨勢與Yozgatian等的研究結果基本一致。正畸快速擴弓時每旋轉螺旋擴大器 1 / 4 圈會產生2000 g 左右的力 ，根據大鼠牙齒是人類牙齒的 1 /2 0 計算，本實驗選擇80g力施加在大鼠磨牙上以模擬臨床施加于患者的正畸重力，此力值未超過臨床使用力值范圍。本實驗剔除了對牙齒正畸移動模型不敏感的大鼠。Y ang等已通過實驗證明空白對照組與陰性對照組各行為反應變化無明顯統計學意義，故本實驗未設置陰性對照組。

在正畸力作用下，牙周膜內出現張力區和壓力區 ，即使使用輕微的力量 ，也能造成牙周組織的損傷 。本實驗結果顯示，實驗組P2Y2和P2Y6 受體的表達變化呈現一定的規律性：模型建立后12h 開始逐漸增加，2 d 表達量達到峰值 ，自3d開始表達量逐漸減 少 ，7d 時受體表達量幾乎與對照組無異。鄭 衍亮等臨床研究發現：牙周疼痛發生時間在正畸加力后1 ~丨2 h不等 ，平均為4 ~ 5 h , 在2 4 ~ 4 8 h 疼 痛達到最高峰 ，加力后72h 疼痛程度才逐漸減 輕 。由此可以看出，本研究觀察到的TG內P2Y2和P2Y6的變化規律與實際臨床中所見的患者的疼痛規律呈一定的相似性。

生理學研究表明，頭面部的傷害性信息是由TG內中等大小（600  ~  1200pm2) 和小神經元（<600 (jun* ) 傳人的。Rodrfguez-Zayas  等曾報道 ，脊髓損傷后P2Y2的表達量在損傷2d后明顯上調，直

至恢復正常 。M alin等報道 :敲除P2Y2 受體的小鼠對熱痛存在 缺陷 。L i等h 5j 研 究 證 明 ，抑制P2Y2 受 體 對三 叉 神 經 痛模 型大 鼠可 以起到 鎮痛作用 。以上實驗均證實P2Y2在疼痛的形成及外周向中樞傳導過程中發揮著重要作用。有研究報道 ，正畸矯治力使牙齒一側組織受壓另一側受牽張，損傷可導致ATP釋 放 ，作用于P2Y2和P2Y6受體并通過第二信引起IP3敏感鈣庫的 Ca2+釋放 ，從而調節神經細胞的功能。本研究觀察到P2Y2和

P2Y6的表達量在模型建立3d后開始出現降低 ，我們推測可能是 局部組織已逐漸適應外界刺激的原因 ，也說明P2Y2和P2Y6的表達變化可隨刺激而變化，是短時間的效應，不是一個持續的變化，也印證了牙移動的一過性疼痛規律 ，與臨床研究結果相符 ，提示 P2 Y2和 p2y6的表達在牙移動疼痛中可能發揮重要作用。 曹陽等研究 發現 , T G 內 P2X, 在實驗性大鼠牙齒移動時表達呈上調趨勢，其 表達在刺激后4 h開始增加,3d 時達到高峰，7d后下降至與對照組基本一致。本實驗對P2Y受體兩個亞型進行實驗，P2Y2和P2Y6受體表達量高峰出現在2d , 較P2X3峰值出現早 ，是否是因為P2Y 受體家族較P2X受體家族能對傷害性刺激做出更迅速的反應，目前尚不十分清楚，需要進行深人研究。本實驗還觀察到P2Y2受體的 表達變化要比P2Y6略明顯，推測P2Y2在致痛過程中可能較P2Y6 具有更重要的作用，而P2Y6是否在P2受體家族中起“先鋒”作 用 ，以及P2Y6受體的激活是否對P2Y2受體的激活有一定的積極作用仍有待進一步深人研究。