圖. 譜系追蹤策略^[1]

自1990年代初以來，基因修飾技術一直用于細胞譜系追蹤，目前已經成為了大多數譜系示蹤研究的首選方法。目前，體內的遺傳細胞追蹤技術主要分為兩種類型，一種是基于KI/TG策略，直接將報告基因與目的基因連接，以達到標記目的細胞的效果；另一種是基于 Cre-loxP 、Dre-rox 、FLP-FRT等基因位點特異性重組酶系統，利用細胞或組織特異性表達的重組酶，特異性地激活報告基因的表達，從而實現特定細胞及所有后代的永久遺傳標記。
 

基于KI/TG策略的細胞標記

使用轉基因（Tg）或基因敲入（KI）的方式，將報告基因整合進目的基因（常為目的細胞marker或細胞特異性表達的啟動子），即可實現針對特定細胞的標記。

這種細胞標記的構建分為以下幾種類型：
01
隨機轉基因
將含有報告基因的外源DNA片段克隆至PiggyBac（PB）轉座子質粒中，與轉座酶一起注射到小鼠受精卵中。在轉座酶作用下，外源DNA片段將會被整合到基因組上的TTAA位點處，從而獲得表達報告基因的小鼠。

02
基因敲入——融合表達

將報告基因敲入到小鼠內源基因的5'端或3'端，與內源基因融合表達。

03
基因敲入——共表達
將報告基因通過2A（自剪切多肽）或IRES（內部核糖體進入位點序列）元件敲入到小鼠內源基因的3'端。

04
基因敲入——取代表達
將報告基因敲入到小鼠內源基因的5'端，并取代小鼠本身的基因，使敲除和敲入同時發生。
 

通過KI/TG策略標記的細胞，僅可標記目前正在表達目的基因的細胞。曾經表達目的基因但現在不表達的細胞，與現在正在表達，但分化后不表達目的基因的后代細胞均不會被報告基因標記。因此，基于KI/TG策略的細胞標記適用于基因表達監測、細胞定位等無需關注目的細胞后代的研究。

基于基因重組酶系統策略的細胞標記

基因位點特異性重組酶系統一般指通過特異位點重組酶 (site-specific recombinases, SSRs) 介導重組酶特異識別位點 (recombination target sites, RTs) 間的重組，來實現特異位點的基因敲除、基因插入、基因翻轉和基因易位等操作。

基于基因位點特異性重組酶系統的細胞標記技術被廣泛應用于器官發育、組織再生和疾病研究。目前，多種重組酶系統被普遍使用，例如Cre-loxP、Flp-frt和Dre-rox系統。其中使用最普遍的為Cre-loxP系統。

01
Cre-loxP系統
借助重組酶系統構建條件性表達報告基因的小鼠模型需要使用到至少兩種類型的小鼠。以Cre/loxP系統為例，首先將攜帶報告基因的DNA序列插入到小鼠的Rosa26位點上，并在啟動子和報告基因之間插入轉錄終止盒（loxp-stop-loxp）構建Flox鼠；同時構建特異性Cre鼠（由特定啟動子驅動或連接在特定細胞marker之后，可在特定細胞或組織表達Cre重組酶）。將上述兩種小鼠交配后，子代中可以獲得既帶有Cre又帶有Flox基因的小鼠，該小鼠在表達Cre重組酶的細胞或組織中，終止盒被Cre重組酶切除，因此僅在這些細胞或組織中才會表達報告基因。
 

02
CreERT2-loxP系統
為實現重組的時間與空間的雙重控制，又進一步開發了CreERT2-loxP系統，可使用他莫昔芬進行誘導重組，從時間上調控Cre-loxp重組。這種方法也被稱為誘導型Cre重組酶系統。
雌激素受體（estrogen receptor，ER）是雌酮、雌二醇等女性荷爾蒙的細胞內蛋白受體。在沒有雌激素的情況下，雌激素受體跟胞質中的熱休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）結合在一起。由于熱休克蛋白的阻擋，雌激素受體無法進入細胞核，只能游蕩于細胞質內。雌激素出現后，雌激素受體會與雌激素結合，并與HSP90解離，后進入細胞核調控基因表達。
CreERT2就是將雌激素受體的配體結合域和Cre酶共表達，借助ERT2的特性，通過他莫昔芬調控基因重組。
 

基于CreERT2系統的細胞標記依賴于他莫昔芬誘導。當他莫昔芬存在時，轉錄終止盒（stop序列）被去除，細胞開始表達報告基因；當他莫昔芬代謝完后，基因重組不會再進行。因而，CreERT2策略標記的細胞來源于他莫昔芬代謝期中表達Marker基因（表達CreERT2）的細胞與這些細胞的后代。在他莫昔芬代謝結束后，即使表達Marker基因（表達CreERT2）的細胞也不會被報告基因標記。

總結：

除了上述外，根據重組類型和數量，基因重組系統可以分為傳統的單重組酶介導的遺傳方法與更復雜的單重組酶介導的多色報告系統方法和多重組酶介導的遺傳方法，下一期鼠博士為大家講解單重組酶介導的多色報告系統。

Reference：
[1] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020;295(19):6413-6424. doi:10.1074/jbc.REV120.011631

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