自綠色熒光蛋白（GFP）點(diǎn)亮生命科學(xué)以來，熒光標(biāo)記技術(shù)不斷突破。傳統(tǒng)明星tdTomato和EGFP雖仍占據(jù)實(shí)驗(yàn)室“C位”，但新一代熒光蛋白如ChR2_H134R/EYFP、GCaMP6f、KikGR、Kaede和mNeonGreen正以獨(dú)特的光學(xué)特性與功能多樣性掀起科研新浪潮。它們不僅能“看見”細(xì)胞，更能“操控”細(xì)胞，甚至解碼疾病機(jī)理。本文將揭秘這五大新銳蛋白的獨(dú)門絕技，剖析其如何賦能神經(jīng)科學(xué)與發(fā)育生物學(xué)。

ChR2_H134R/EYFP：光控神經(jīng)回路的“開關(guān)大師”
ChR2_H134R/EYFP是一種光遺傳學(xué)工具，融合了光敏感離子通道ChR2與增強(qiáng)型黃色熒光蛋白EYFP，ChR2蛋白攜帶的功能增益突變（H134R）可產(chǎn)生更大的電流、更高的光敏性和更低的脫敏性。ChR2_H134R可通過藍(lán)光照射激活神經(jīng)元并產(chǎn)生動(dòng)作電位，而EYFP則用于可視化表達(dá)ChR2_H134R的細(xì)胞，幫助研究人員確認(rèn)目標(biāo)細(xì)胞的位置和分布 ^[1-2]。EYFP的發(fā)射波長(zhǎng)為527 nm，與藍(lán)光激發(fā)的ChR2_H134R（~470 nm）兼容性良好，避免了光譜重疊導(dǎo)致的信號(hào)干擾問題。

圖1. ChR2_H134R/EYFP報(bào)告品系用于心臟成纖維細(xì)胞的研究 ^[3]。

RCL-ChR2_H134R/EYFP小鼠（產(chǎn)品編號(hào)：I001027）是在Rosa26位點(diǎn)條件性表達(dá)ChR2_H134R/EYFP的熒光報(bào)告模型。Cre重組前，ChR2_H134R/EYFP的表達(dá)被上游loxP-Stop-loxP元件阻斷；當(dāng)與Cre小鼠交配后，可在子代表達(dá)Cre的組織中特異性表達(dá)ChR2_H134R/EYFP融合蛋白。該模型為光遺傳學(xué)研究提供了理想的工具動(dòng)物，通過450-490 nm藍(lán)光照射即可在體內(nèi)精確、快速地激活目標(biāo)興奮性細(xì)胞。

GCaMP6f：鈣瞬變的“高速攝像機(jī)”
鈣離子指示劑一般分為兩類：化學(xué)鈣離子指示劑和基于蛋白質(zhì)的基因編碼鈣離子指示劑（GECIs）。由于可以控制向目標(biāo)細(xì)胞類型的特定傳遞，GECIs成為腦功能研究中的首選。GCaMP6是一種綠色熒光基因編碼鈣離子指示劑，因其在檢測(cè)神經(jīng)元鈣離子瞬態(tài)的高靈敏度而被廣泛用于測(cè)量神經(jīng)元活動(dòng)，在某些條件下它甚至能檢測(cè)到由單個(gè)動(dòng)作電位引起的單個(gè)鈣離子瞬態(tài) ^[4]。GCaMP6f由鈣調(diào)蛋白（CaM）、環(huán)狀排列的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（cpEGFP）以及肌球蛋白輕鏈激酶M13結(jié)構(gòu)域（M13）組成。在無鈣離子存在的條件下，cpEGFP無法發(fā)揮其功能；而當(dāng)CaM與鈣離子結(jié)合后，能夠與M13結(jié)構(gòu)域相互作用，進(jìn)而引起cpEGFP構(gòu)象的改變，此時(shí)cpEGFP可被激發(fā)并產(chǎn)生熒光信號(hào)。

圖2. GCaMP6f小鼠用于植入式神經(jīng)刺激系統(tǒng)療法中神經(jīng)信號(hào)激活監(jiān)測(cè) ^[5]。

RCL-GCaMP6f小鼠（產(chǎn)品編號(hào)：I001028）是在Rosa26位點(diǎn)條件性表達(dá)GCaMP6f的熒光鈣指示工具模型。Cre重組前，GCaMP6f的表達(dá)被上游Stop元件框阻斷；當(dāng)與Cre小鼠交配后，Cre重組酶介導(dǎo)的loxP位點(diǎn)特異性重組將Stop序列移除，經(jīng)過鈣結(jié)合（如神經(jīng)元激活）可觀察到明亮的熒光信號(hào)。

KikGR與Kaede：細(xì)胞命運(yùn)的“時(shí)空記錄儀”
KikGR與Kaede是一類光轉(zhuǎn)換熒光蛋白，能夠在紫外光激發(fā)下實(shí)現(xiàn)從綠色熒光到紅色熒光的不可逆轉(zhuǎn)換。這一特性突破了傳統(tǒng)熒光蛋白（如tdTomato）在時(shí)空標(biāo)記方面的局限性，為細(xì)胞追蹤與命運(yùn)圖譜研究提供了強(qiáng)有力的工具。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，KikGR的光電轉(zhuǎn)換效率更高，在綠色和紅色狀態(tài)下的亮度是Kaede的數(shù)倍 ^[6-7]。

圖3. 紫外光照射改變表達(dá)Kaede的細(xì)胞及Kaede轉(zhuǎn)基因小鼠的熒光特性 ^[8]。

Rosa26-CAG-KikGR小鼠（產(chǎn)品編號(hào)：I001211）是賽業(yè)生物通過基因編輯技術(shù)將CAG promoter-Kozak-KikGR-rBG pA基因表達(dá)組件整合到小鼠Rosa26位點(diǎn)中構(gòu)建的，KikGR蛋白可在小鼠體內(nèi)廣泛性地表達(dá)。除此之外，賽業(yè)還可提供類似的Kaede熒光報(bào)告鼠——Rosa26-CAG-Kaede小鼠（產(chǎn)品編號(hào)：I001118）。

mNeonGreen：超分辨成像的“燈塔”
作為GFP的升級(jí)版，mNeonGreen在活體成像中的亮度比GFP高出3倍-5倍，尤其在低表達(dá)組織中的檢測(cè)能力更強(qiáng)，能夠揭示GFP難以捕捉的微弱表達(dá)模式。其506/517 nm激發(fā)發(fā)射光譜完美兼容多色成像，mNeonGreen廣泛應(yīng)用于超分辨率顯微鏡和活細(xì)胞成像。此外，mNeonGreen被成功用于追蹤內(nèi)源性蛋白質(zhì)，并標(biāo)記特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如細(xì)胞核和質(zhì)膜，特別適合用于精細(xì)的亞細(xì)胞定位研究 ^[9]。

圖4. mNeonGreen蛋白呈現(xiàn)比GFP蛋白更好的體內(nèi)成像效果 ^[10]。

TG-CAG-mito-mNeonGreen小鼠（產(chǎn)品編號(hào)：I001183）是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將CAG-mito-mNeonGreen基因表達(dá)元件整合到小鼠基因組中構(gòu)建的。該模型可用于線粒體的功能、定位和動(dòng)態(tài)等研究，是研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)的理想工具。

“我們不僅需要更亮的熒光，更需要聰明的光”。從“看見細(xì)胞”到“操控生命”，新型熒光蛋白正重新定義生命科學(xué)的邊界。

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