乳腺癌是全球女性中最常見的惡性腫瘤，其發病率居高不下，嚴重威脅著女性的健康。近年來，隨著醫學成像技術的不斷進步，多光子顯微技術（MPM）作為一種先進的醫學成像手段，逐漸在乳腺癌的診斷和預后預測中展現出巨大的潛力。

研究背景與技術挑戰
乳腺癌的全球現狀
乳腺癌長期以來占據全球女性惡性腫瘤發病率的首位。根據國際癌癥研究機構（IARC）最新發布的2020年全球癌癥負擔數據，乳腺癌的發病數已經超過肺癌，成為全球第一大癌癥。乳腺癌的高度異質性使得患者的個體差異顯著，因此，如何準確預測乳腺癌的生物學行為，成為臨床治療中的一大挑戰。

技術挑戰
盡管多光子顯微技術在成像分辨率、無標記、免切片、光學層析成像等方面具有顯著優勢，但其在乳腺癌預后預測中的應用仍面臨諸多挑戰。首先，乳腺癌的微環境復雜，包含多種細胞和基質成分，如何準確識別和量化這些成分的變化是一個難題。其次，現有的預后預測模型主要依賴于腫瘤細胞的形態學和分子表達信息，忽略了腫瘤微環境在腫瘤發生、發展和轉移中的重要作用。因此，開發一種能夠綜合考慮腫瘤微環境特征的預后預測系統，成為當前研究的重點。

技術創新與應用
多光子顯微技術的原理創新
多光子顯微技術的核心創新是基于的非線性光學效應，即雙光子激發熒光（TPEF）和二次諧波（SHG）。雙光子激發熒光是一個三階非線性吸收過程。在這個過程中，一個熒光分子或者原子同時吸收兩個相同頻率的光子，獨特的激發方式使得雙光子激發熒光具有更高的空間分辨率和更深的成像深度，能夠在不破壞組織的情況下對深層組織進行成像。

二次諧波是一種二階非線性光學現象，也稱為 “倍頻”。當具有相同頻率的兩個光子與非線性介質相互作用時，其輸出光子頻率為入射光子頻率的二倍，這個輸出的二倍頻光波就是二次諧波。二次諧波的產生與介質的二階極化率密切相關，而二階極化率又與介質本身的特性，如電子態、分子對稱性、旋向及排列等有關。因此，二次諧波可以作為一種靈敏的組織材料特性指標，反映介質的微觀結構特性。
在乳腺腫瘤研究中的應用優勢

多光子顯微技術在乳腺腫瘤微環境研究中無需外源性染色劑，就能對各種組分進行成像，避免了染色劑對組織的干擾和損傷。該技術具有光學層析成像能力，可以實現對組織的三維成像，全面觀察腫瘤微環境的結構和組成。多光子顯微技術能夠反映細胞的功能代謝信息，通過分析細胞的熒光信號強度和光譜特征，可以了解細胞的代謝狀態和功能活性。此外，還具有三維靶向消融能力、較低的光漂白與光損傷以及高成像對比度等優勢，為乳腺癌的研究和診斷提供了有力的工具。

成像實驗與結果分析
膠原纖維成像結果及分析
形態特征分析：通過對膠原纖維的SHG成像，直接從多光子顯微圖像上分析其形態特征。Han等利用膠原纖維SHG光的偏振性和方向性，確定了小鼠乳腺腫瘤模型中膠原蛋白與健康乳腺脂肪墊間的結構關系。研究發現，產生SHG的膠原亞群不受腫瘤間質膠原合成改變的影響，且受到異常降解環境的保護。通過對正向和反向傳播SHG信號的比值進行定量分析，能夠監測整個導管和小葉癌發展過程中的膠原纖維變化。Natal等對不同類型浸潤性乳腺癌患者的組織切片進行SHG成像并評價膠原參數，結果表明通過膠原參數可以識別出三種主要的乳腺癌組。研究小組將這種膠原纖維重塑特征定義為腫瘤相關膠原纖維特征（TACS1-3）。

計算機輔助圖像分析：Falzon等利用SHG成像對正常和病變乳腺組織中的膠原纖維形態改變進行定性分析，并采用橢圓傅里葉分析量化相關指標來區分乳腺腫瘤的性質。Bredfeldt等利用大視場高分辨率顯微鏡技術、圖像處理和監督學習方法，半自動化地量化膠原纖維排列特征，實現了TACS候選生物標志物的半自動采集和分析，其量化得分可準確預測乳腺癌患者的生存期。Majeed等利用新的無標記定量相位成像技術，更快速地提取膠原纖維定向排列信息以反映乳腺疾病的不同分期。

Natal等通過SHG成像量化管腔型乳腺腫瘤患者瘤周與瘤內膠原纖維特征差異，發現較高的瘤內膠原纖維一致性與較高的病理分期和腋窩淋巴結轉移相關。Gole等采用基于雙模式高斯混合模型（GMM）的計算機輔助圖像分析方法，細化膠原纖維特征，比較不同定量參數對三陰性乳腺癌預后的價值。Sprague等基于curvelet變化算法更全面地提取乳腺導管原位癌病變周圍膠原纖維的形態特征，這些特征與乳腺導管原位癌的復發風險相關。Xi等采用基于高斯混合模型的分割算法和纖維網絡提取算法等，建立的TCMF-score具有較強的預后性能，對所有乳腺癌患者都有很好的預后預測能力。

腫瘤浸潤淋巴細胞成像結果及分析
腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）是腫瘤微環境的重要組成部分，與乳腺癌患者預后密切相關，可分為間質腫瘤浸潤淋巴細胞（sTILs）和上皮內腫瘤浸潤淋巴細胞（iTILs）。不同研究表明，高密度TILs浸潤對不同分子亞型的乳腺癌預后影響不同，對ER陰性的三陰性乳腺癌及HER2過表達型乳腺癌有較好預后，而對ER陽性的管腔型患者預后效果尚無定論。

He等直接從無標記病理樣品的多光子顯微病理圖像出發，根據TILs與腫瘤細胞、膠原纖維的相對位置將TILs重新分為3種。基于這三種模式的出現頻率，結合嶺回歸分析提出了一種評估TILs預后價值的新方法，即腫瘤浸潤性淋巴細胞評分（TILs-score）。醫學統計分析結果表明，TILs-score對ER陽性乳腺癌患者具有更強的預后價值。

深遠意義與未來展望
在臨床方面，分析腫瘤微環境中膠原纖維、腫瘤浸潤淋巴細胞等組分，能精準預測患者預后，助力醫生制定個性化方案，避免治療不當，提升患者生存率與生活質量，比如對不同風險評分患者采取差異化治療。在科研上，為乳腺癌基礎研究提供新途徑，有助于探究腫瘤微環境作用機制及細胞與組織關系，為開發新療法提供理論依據。在未來，基于腫瘤微環境的乳腺癌預測模型是發展趨勢。一方面要優化多光子顯微成像技術，如研發先進設備、結合新型成像技術獲取更多信息；另一方面要加強計算機輔助圖像分析研究，利用人工智能等構建更精準的預后評估模型。此外，還需開展多中心大樣本臨床研究，推動該技術廣泛應用，為乳腺癌患者帶來希望。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
徐順武, 何佳佳, 席剛琴, 李連煌, 韓俠輝, 鄭莉琴, 陳建新. 多光子顯微技術在乳腺腫瘤微環境預后預測研究中的應用進展[J]. 激光與光電子學進展, 2022, 59(6): 0617013. 

DOI:10. 3788/LOP202259. 0617013.