免疫熒光技術實驗技巧匯總
免疫熒光技術是根據抗原抗體反應的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原（或抗體）。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發光的照射而發生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細胞，從而確定抗原或抗體的性質、定位，以及利用定量技術測定含量。
免疫熒光步驟包括，細胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等。除了這些基本步驟，接下來的實驗技巧方法如下：
1. 細胞固定和通透
為達到蕞佳的檢測效果，細胞需要經過固定和通透。步驟很重要，細胞和抗原需要保證蕞佳的結構，并利于抗體與抗原結合。通常情況下，
2. 抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助精-準定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利于減少降低背景干擾。
3. 合適的抗體稀釋比例
通過優化抗體稀釋比例來優化染色，通常情況下 1ug/ml 的純化抗體或者 1:100-1:1000 的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強度。如果是第1次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗。
4. 優化緩沖液和封閉劑
盡管很多抗原在常見的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是對于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。Rockland 可提供優化過的 IHC 用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實驗。
5. 選擇正確的二抗
如果您需要做免疫實驗，我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那么必須使用預吸附的二抗。同時，請優先選擇來自同一物種的二抗。
6. 使用合適的細胞密度
選擇合適的細胞數量進行染色，當細胞數量過多時，細胞結構不好，導致染色背景深，低細胞密度，會使細胞貼壁不佳，狀態不好。
7. 多重染色
對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進行同時染色，但要求兩個一抗的種屬來源不同，標記物不同，而二抗的種屬來源需保持一致。
8. 降低背景
高背景是免疫熒光常見的問題，解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替 BSA 做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數，洗滌至少三次，每次五分鐘，洗滌液為 PBS+0.05%Tween。
9. 封片
作為免疫熒光的蕞后一步，可以提高折射率，保護樣品。
10. 數據分析
觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細胞進行數據獲取與分析。
以上就是免疫熒光檢測的 10 種技巧方法，希望可以更好的服務于您的實驗，為您的實驗保駕護航！
免疫熒光步驟包括，細胞固定和通透，封閉，孵育一抗，二抗等。除了這些基本步驟，接下來的實驗技巧方法如下：
1. 細胞固定和通透
為達到蕞佳的檢測效果，細胞需要經過固定和通透。步驟很重要，細胞和抗原需要保證蕞佳的結構，并利于抗體與抗原結合。通常情況下，
2. 抗體特異性
免疫熒光需要用到特異性非常強的抗體，可以避免高背景和不理想的蛋白定位結果。在大多數情況下，純化抗體的效果很好，但是正確的對照可以幫助精-準定位抗原。使用只有二抗染色的片子作為陰性對照，有利于減少降低背景干擾。
3. 合適的抗體稀釋比例
通過優化抗體稀釋比例來優化染色，通常情況下 1ug/ml 的純化抗體或者 1:100-1:1000 的抗血清足夠達到特異性染色的結果。但在能保證低背景染色的前提下，可以通過增加濃度來提高信號強度。如果是第1次使用該抗體或測定某抗原，強烈建議濃度梯度實驗。
4. 優化緩沖液和封閉劑
盡管很多抗原在常見的 Buffer 如 PBS 中可以很好的被染色，但是對于某些目的抗原，更換一下含有不同離子的緩沖液，比如鈣、鎂、鉀等，可以帶來很大程度上的改善。Rockland 可提供優化過的 IHC 用封閉緩沖液，同樣適用于熒光染色實驗。
5. 選擇正確的二抗
如果您需要做免疫實驗，我們強烈建議您選擇進行過預吸附的二抗進行單染實驗；如果是雙重甚至是多重染色，那么必須使用預吸附的二抗。同時，請優先選擇來自同一物種的二抗。
6. 使用合適的細胞密度
選擇合適的細胞數量進行染色，當細胞數量過多時，細胞結構不好，導致染色背景深，低細胞密度，會使細胞貼壁不佳，狀態不好。
7. 多重染色
對同一樣本進行兩個不同抗原的檢測時，可以用各自的抗體進行同時染色，但要求兩個一抗的種屬來源不同，標記物不同，而二抗的種屬來源需保持一致。
8. 降低背景
高背景是免疫熒光常見的問題，解決此問題可以用二抗來源的正常血清代替 BSA 做封閉液，降低抗體濃度，增加洗滌次數，洗滌至少三次，每次五分鐘，洗滌液為 PBS+0.05%Tween。
9. 封片
作為免疫熒光的蕞后一步，可以提高折射率，保護樣品。
10. 數據分析
觀察整體樣片時，選擇具有代表性的細胞進行數據獲取與分析。
以上就是免疫熒光檢測的 10 種技巧方法，希望可以更好的服務于您的實驗，為您的實驗保駕護航！
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