神經退行性疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病等，目前仍缺乏有效的治療手段。想要攻克這些難題，深入了解大腦在疾病狀態下的結構和功能變化至關重要，而這離不開強大的成像技術支持。今天，就讓我們一同走進大腦成像的前沿領域，探索組織透明化和膨脹顯微成像技術的神奇之處。
 

研究背景
大腦成像：神經退行性疾病研究的關鍵鑰匙
神經退行性疾病種類繁多，包括阿爾茨海默病（AD）、帕金森病（PD）、亨廷頓病（HD）、肌萎縮側索硬化癥（ALS）和額顳葉癡呆（FTD）等。大腦的結構和功能極其復雜，不同細胞群體之間的連接和活動模式決定了其功能。在神經退行性疾病中，特定細胞類型的結構變化往往是疾病發生發展的基礎。要深入理解神經退行性疾病的發病機制，就需要對大腦進行全面、細致的成像分析，從細胞和分子層面揭示其病理變化。然而，標準光學顯微鏡受光衍射極限的限制，而電子顯微鏡雖然能實現高分辨率的超微結構分析，但缺乏多色熒光顯微鏡的分子特異性和通量，難以同時對多個目標進行成像。

突破成像障礙：組織透明化的誕生
該技術通過使組織的折射率均勻化，讓樣本變得透明，從而可以使用熒光顯微鏡從一端到另一端對樣本進行成像。其中，光片熒光顯微鏡（LSFM）是一種非常有效的成像工具，它能產生薄激光片來照亮整個樣本中的單個平面，實現對大型標本（如整個小鼠大腦甚至完整的人體器官）的高速、高分辨率成像。

技術創新與應用
超越衍射極限：膨脹顯微成像的原理與優勢
為了突破光學顯微鏡的衍射極限，實現對亞細胞結構的高分辨率成像，科研人員開發了多種光學超分辨率顯微鏡（SRM）方法，如受激發射損耗（STED）顯微鏡、光活化定位顯微鏡（PALM）、結構光照明顯微鏡（SIM）和隨機光學重建顯微鏡（STORM）等。這些方法雖然能夠分辨30-100nm，但存在設備昂貴、操作復雜、多色成像困難等問題，限制了其在大多數生物醫學研究實驗室的廣泛應用。

膨脹顯微成像（ExM）通過使用可膨脹的水凝膠在整個組織中交聯，誘導樣本各向同性膨脹，從而使樣本中的結構在常規光學顯微鏡下也能實現超分辨率成像。目前的組織膨脹方法可以使組織實現高達約4.5倍、10倍甚至約20倍的各向同性膨脹，使用常規共聚焦顯微鏡就能實現高達約25nm分辨率的亞細胞結構成像。膨脹顯微成像操作相對簡單，并且與多色免疫染色和熒光原位雜交（FISH）兼容，能夠為神經病理學研究提供豐富的分子和結構信息。

膨脹顯微成像下的神經退行性疾病：新的發現與見解
膨脹顯微成像在神經退行性疾病研究中發揮了重要作用，為我們揭示了許多以往難以觀察到的微觀變化。在研究亨廷頓病時，不同的光學SRM方法，如STORM和STED SRM，被用于研究亨廷頓蛋白聚集狀態，包括在活細胞、固定細胞中和其他纖維狀物質的形成；SIM SRM則用于研究突變的亨廷頓蛋白（mHTT）聚集體與轉錄因子的相互作用，這可能導致了基因表達的改變。

在阿爾茨海默病研究中，不同的光學SRM方法幫助研究人員在體外和細胞模型，STED SRM還用于對死后大腦切片中的免疫標記進行成像。此外，還利用拓增顯微鏡發現了一些與神經退行性疾病相關的新結構和分子機制。

成像實驗與結果分析
透明化助力疾病研究：在神經病理學中的應用實例
組織透明化技術為神經病理學研究帶來了新的契機，讓科研人員能夠在更大的空間尺度上評估神經病理特征。在阿爾茨海默病研究中，研究人員利用組織透明化方法取得了許多重要發現。例如，Huang及其同事使用熒光染料對斑塊進行染色，結合使用熒光團標記的凝集素對血管進行標記，并對整個小鼠大腦進行透明化處理。Hama等人應用組織透明化方法，在小鼠和人類大腦的整個半腦以及1-2mm厚的切片中可視化斑塊、小膠質細胞和大腦超微結構，通過對斑塊、神經元和小膠質細胞的染色，發現能較好地保留大腦超微結構，有助于使用顯微鏡檢測突觸后密度。此外，基于水凝膠的方法也被用于可視化人類大腦樣本中，以及在小鼠模型中觀察黑質紋狀體軸突的碎片化和人類大腦中的路易小體病理。

聯合應用的潛在價值
在神經病理學研究中，組織透明化方法可以與細胞類型特異性標記、突觸標記以及神經元-星形膠質細胞興奮性指標或神經膠質反應性指標的分析相結合，識別出受病理影響的相關大腦回路，研究不同神經病理如何影響全腦特定細胞群體的活動，從而深入了解神經退行性疾病中不同回路和神經元-神經膠質亞型選擇性-差異性易損性的細胞機制。同時，結合自動成像和數據分析，可以評估潛在的治療策略。而膨脹顯微鏡則可以進一步深入研究細胞類型特異性的分子機制，mRN和蛋白質定位的改變、局部突觸翻譯、蛋白質-蛋白質相互作用和病理蛋白質聚集等。

深遠意義與展望未來
隨著技術的不斷發展，組織透明化和膨脹顯微成像技術在未來還有很大的提升空間。在組織化學和光學方面的進步，以及開源光片顯微鏡的發展，將提高這些技術的適用性，增加可成像的生物分子范圍和分辨率。同時，計算技術的發展，包括優化的數據分析工具、標準化的流程、數據格式和數據共享平臺，將有助于對大量的腦成像數據進行定量評估和系統生物學層面的解釋，推動神經退行性疾病研究取得更多突破。雖然目前這些技術還面臨一些挑戰，但隨著科學技術的不斷進步，我們能夠借助它們徹底揭開神經退行性疾病的神秘面紗，為無數患者帶來新的希望。

論文信息
聲明：本文僅用作學術目的。
Parra-Damas A, Saura CA. Tissue Clearing and Expansion Methods for Imaging Brain Pathology in Neurodegeneration: From Circuits to Synapses and Beyond. Front Neurosci. 2020 Oct 5;14:914.
DOI：10.3389/fnins.2020.00914.