PCR實驗技巧：最常見的問題解析
1. 如何有效設計引物
（1）使用Oligo或Primer設計引物，在保守區內設計，長度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之間不應存在互補序列，避免發夾結構。
2. PCR電泳無擴增條帶
（1）酶失活或在反應體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。
（2）模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。
（3）變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模板變性不徹底。
（4）反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5-10分鐘。
（5）引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。
（6）引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
（7）DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。
3. PCR產物量過少
（1）退火溫度不合適。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。
（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3）PCR循環數不足。增加反應循環數。
（4）引物量不足。增加體系中引物含量。
（5）延伸時間太短。以1kb/分鐘的原則設置延伸時間。
（6）變性時間過長。變性時間過長會導致DNA聚合酶失活。
（7）DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈
4. 擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
（1）酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。
（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
（3）MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。
（4）模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。
（5）引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。
（6）循環次數過多；增加模板量減少循環次數至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環。
（7）退火溫度過低。
（8）電泳體系有問題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
②凝膠沒有凝固好；
③瓊脂糖質量差。
（9）若為PCR試劑盒則可能：
①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；
②試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。
（10）降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。
5. 擴增產物出現多條帶（雜帶）
（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
（2）循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。
（3）酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。
（4）退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。
（5）樣品處理不當。
（6）Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。
（7）若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。
（8）復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。
（9）反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。
（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
（11）引物量過多。減少反應體系中引物的用量。
（12）模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。
（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈。
6. 陰性對照出現條帶
試劑，槍頭，工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。
7. 條帶大小與理論不符
（1）污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。
（2）模板或引物使用錯誤。查看引物是否會擴增部分條帶和模板是否正確。
（3）基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。
8. 持續出現假性條帶
起始退火溫度太低，或目的擴增產物和非目的產物的T值相差不大。可嘗試適當提高PCR溫度或者設置降落PCR，降低循環數。
9. 菌落PCR檢測有條帶，接種大搖后無條帶
可重新以菌落和菌液為模板進行PCR對照檢測，因為菌落PCR的假陽性概率還是比較高。如果仍出現上述結果，推測可能是平板上連接液中的未連接載體的擴增引起的目的條帶，進一步質粒PCR檢測，可證明目的片段是否真正連接成功。
（1）使用Oligo或Primer設計引物，在保守區內設計，長度一般在18-27bp，上下游引物Tm值最好是60-75℃，GC含量=40%-60%，引物自身及引物之間不應存在互補序列，避免發夾結構。
2. PCR電泳無擴增條帶
（1）酶失活或在反應體系中未加入酶。TaqDNA聚合酶因保存或運輸不當而失活，往往通過更換新酶或用另一來源的酶以獲得滿意的結果。
（2）模板含有雜質。特別是對甲醛固定及石蠟包埋的組織常含甲酸，造成DNA脫嘌呤而影響PCR的結果。
（3）變性溫度是否準確：PCR儀指示溫度與實際溫度是否相符，過高酶在前幾個循環就迅速失活；過低則模板變性不徹底。
（4）反應系統中污染了蛋白酶及核酸酶，應在未加Taq酶以前，將反應體系95℃加熱5-10分鐘。
（5）引物變質失效。人工合成的引物是否正確。是否純化，或因儲存條件不當而失活。
（6）引物錯誤。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
（7）DNA凝膠電泳時加入陽性對照，確保不是DNA凝膠和PCR程序的問題。
3. PCR產物量過少
（1）退火溫度不合適。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。
（2）DNA模板量太少。增加DNA模板量。
（3）PCR循環數不足。增加反應循環數。
（4）引物量不足。增加體系中引物含量。
（5）延伸時間太短。以1kb/分鐘的原則設置延伸時間。
（6）變性時間過長。變性時間過長會導致DNA聚合酶失活。
（7）DNA模板中存在抑制劑。確保DNA模板干凈
4. 擴增產物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散
（1）酶量過高。減少酶量；酶的質量差，調換另一來源的酶。
（2）dNTP濃度過高。減少dNTP的濃度。
（3）MgCl2濃度過高。可適當降低其用量。
（4）模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。
（5）引物濃度不夠優化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應。
（6）循環次數過多；增加模板量減少循環次數至30，縮短退火時間及延伸時間，或改用二種溫度的PCR循環。
（7）退火溫度過低。
（8）電泳體系有問題：
①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大；
②凝膠沒有凝固好；
③瓊脂糖質量差。
（9）若為PCR試劑盒則可能：
①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效；
②試劑盒本身質量有問題，如引物選擇、循環參數等選擇不當。
（10）降解的陳舊模板擴增也易產生涂布。
5. 擴增產物出現多條帶（雜帶）
（1）引物用量偏大，引物的特異性不高。應調換引物或降低引物的使用量。
（2）循環的次數過多。適當增加模板的量，減少循環次數。
（3）酶的用量偏高或酶的質量不好，應降低酶量或調換另一來源的酶。
（4）退火溫度偏低，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度，減少變性與延伸時間，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優化退火溫度。
（5）樣品處理不當。
（6）Mg2+濃度偏高，因適當調整Mg2+使用濃度。
（7）若為PCR試劑盒，也可能時試劑盒本身質量有問題。
（8）復制提前終止。使用非熱啟動的聚合酶時常有發生。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。
（9）反應緩沖液未完全融化或未充分混勻。確保反應緩沖液融化完全并徹底混勻。
（10）引物特異性差。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。
（11）引物量過多。減少反應體系中引物的用量。
（12）模板量過多。質粒DNA的用量應<50ng，而基因組DNA則應<200ng。
（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈。
6. 陰性對照出現條帶
試劑，槍頭，工作臺污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。
7. 條帶大小與理論不符
（1）污染。使用全新的試劑和槍頭，對工作臺進行清潔。
（2）模板或引物使用錯誤。查看引物是否會擴增部分條帶和模板是否正確。
（3）基因亞型。對研究的基因進行序列分析和BLAST研究。
8. 持續出現假性條帶
起始退火溫度太低，或目的擴增產物和非目的產物的T值相差不大。可嘗試適當提高PCR溫度或者設置降落PCR，降低循環數。
9. 菌落PCR檢測有條帶，接種大搖后無條帶
可重新以菌落和菌液為模板進行PCR對照檢測，因為菌落PCR的假陽性概率還是比較高。如果仍出現上述結果，推測可能是平板上連接液中的未連接載體的擴增引起的目的條帶，進一步質粒PCR檢測，可證明目的片段是否真正連接成功。
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