人類染色體在遺傳過程中，有時候會丟失或增加一部分，遺傳學將這種DNA的增減現象稱為拷貝數變異（CNV）。CNV通常為長度大于1kb的片段變異，里面往往包含一個或多個基因，若變異片段包含功能特別重要、對劑量水平敏感的基因，就會導致疾病的發生，可導致智力低下、發育異常等癥狀，引起殘疾、甚至死亡。

外顯子不同于基因組，由于是捕獲測序，本身就是各個外顯子區域分割開來，這樣造成2個影響：（1）大片段的CNV被切開形成多個假陽性；（2）只能檢測小的CNV。因此對檢測軟件要求很靈敏。

目前有很多檢測CNV的工具，比如CNVseq、CNVnator/CNVpytor、Conifer、WisecondorX等，但這些工具要么是安裝難度大，要么是不適合外顯子CNV檢測，又或者使用繁瑣。有沒有一種安裝方便、用法簡單、適合外顯子CNV檢測的工具？就是今天要說的CNVkit。

CNVkit于2016年發表在PLOS computational biology上，詳見《CNVkit: Genome-Wide Copy Number Detection and Visualization from Targeted DNA Sequencing》。CNVkit是基于Python3.7+開發的一款專門用于基因組高通量測序數據拷貝數變異（CNV）檢測工具，并提供多種可視化方法。

CNVkit分析流程示意圖

 
該方法將in-target和off-target區域劃分成小的bin區間，統計每個bin區間內的測序深度、GC含量，并通過GC含量、目的區域的大小和分布密度等對原始測序深度進行校正，去除腫瘤樣本中的背景噪音，然后計算腫瘤樣本相對正常樣本對應位置拷貝數的log2 ratio值, 最后采用segment算法進行過濾，得到最終的腫瘤樣本拷貝數變異結果。

軟件安裝使用介紹

1、通常我們使用conda安裝，另外需要額外安裝R包DNAcopy，因為CNVkit內部需要借助DNAcopy包進行拷貝數估算，安裝沒什么幺蛾子，比較順利。
2、需要下載基因注釋文件，用于對CNV結果進行基因注釋，這倒省了我們單獨注釋的麻煩。該文件可以在UCSC上下載
PS：如果需要做hg38或其他物種，可以從NCBI下載物種基因組注釋文件（gtf或gff格式），提取信息自行制作refFlat.txt.gz文件，格式跟UCSC下載的保持一致即可。
3、參考基因可在NCBI或UCSC上下載，需要與refFlat.txt.gz文件基因信息一致。
4、樣本bam數據，參考BWA流程獲得。
5、一鍵運行：
$cnvkit access $ref -s $window -o $out/access-${window}.bed
$cnvkit.py batch --method hybrid $Tumor.bam \
--normal $Normal.bam\
--annotate $refFlat \
--fasta $ref \
-t $target.bed \
--access $out/access-${window}.bed \
-d $output \
--segment-method hmm \
--diagram \
--scatter \
-p 6
PS：使用CNVkit的batch命令，可以一步完成所有分析步驟，最后用--diagram和--scatter用于繪制拷貝數變異總覽圖和染色體分布圖，不需要可以不使用。

文獻摘錄

這里介紹一篇發表于2022年的文章《Gliosarcoma: The Distinct Genomic Alterations Identified by Comprehensive Analysis of Copy Number Variations》，研究者使用CNVkit對膠質母細胞瘤（GBM）和膠質肉瘤（GSM）的DNA拷貝數變異（CNV）進行了全面分析，下圖就展示了21例GBM 和15例GSM 樣本拷貝數變異在染色體上的分布（該圖使用CNVkit自帶參數heatmap生成）。

Figure 1 橫坐標是染色體，縱坐標是樣本，紅色表示拷貝數擴增，藍色表示拷貝數缺失，顏色越深，表示拷貝數擴增/缺失越多