文章來源： ：SinoTalk為承諾發聲，作者：中新小魚

人源多能性干細胞是一類具有自我更新和多向分化能力的細胞，包括從體內胚胎分離獲得的胚胎干細胞(Human Embryonic Stem Cells, hESCs)和體外誘導獲得的多能性干細胞(Human Induced Pluripotent Stem Cells, hiPSCs)。人源干細胞是進行細胞多能性維持機理研究、體細胞重編程機制研究和疾病發病機制研究等基礎研究的重要研究對象。同時，人源干細胞也作為遺傳性疾病治療藥物篩選、體外器官構建的“種子”細胞，在疾病治療和再生醫學治療中具有重要價值。

盡管已經經過幾十年的發展，人源干細胞的培養技術還有待完善。人源干細胞培養過程中的一個重大技術瓶頸是人源干細胞在傳代，單細胞克隆和凍存復蘇過程中容易凋亡，導致其存活率非常低。這個技術難題對人源干細胞的培養，基因編輯，以及人源干細胞產品的凍存復蘇都造成巨大的困難。日本科學家Kiichi Watanabe和Yoshiki Sasai在2009年率先發現Rho-associated Kinase（ROCK）的抑制劑Y-27632可以有效抑制人源干細胞在傳代過程中的細胞凋亡。Y-27632的發現極大地優化了人源干細胞的培養流程，目前已經被廣泛運用。然而，Y-27632并未能徹底解決人源干細胞凋亡的問題。目前，即使在使用Y-27632的條件下，人源干細胞在單細胞克隆，以及凍存復蘇過程中依然面臨存活極低的困難。這個技術瓶頸在過去十多年中一直困擾著人源干細胞在基因編輯中的運用以及干細胞產品高效凍存復蘇的實現.

2021年5月3日， 美國國立衛生研究院轉化醫學研究中心干細胞轉化實驗室的陳宇博士，陳璐博士和鄧濤博士等在Nature Methods上發表論文A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells，首次報道了一個顯著提升人源干細胞在單細胞克隆和凍存復蘇過程中的存活率的四組分配方 CEPT（Chroman1， Emricasan， polyamines 和trans-ISRIB）。CEPT通過同時阻斷多個誘發人源干細胞凋亡的信號通路，實現了顯著提升人源干細胞在多種極端條件下的存活率。

圖1. 干細胞存活篩選示意圖。

論文作者首先發展了監測人源干細胞存活的藥物高通量篩選實驗體系，然后通過藥物高通量篩選平臺測試了15333個化合物。在他們發現的113個具有活性的化合物中，Chroman1是一個非常有效的ROCK抑制劑。它比目前廣泛使用的Y-27632對ROCK的抑制更加有效，同時選擇性更好。

圖2. 干細胞存活組合篩選示發現Chroman1和Emricasan

隨后，作者從113個有活性的化合物中挑選了29個代表不同作用機制的化合物進行了組合篩選（Matrix Screen）。通過測試812個組合，作者發現Chroman1和Caspase抑制劑Emricasan有明顯的協同作用。同時使用Chroman1和Emricasan可以顯著減少人源干細胞在細胞傳代過程中的凋亡。

圖3. 干細胞存活三個化合物的組合篩選示發現Chroman1+Emricasan+tISRIB

人源干細胞存活的極限挑戰是單細胞克隆。在這個流程中，通過流式細胞儀每一個干細胞被單獨放到96孔細胞培養板的一個孔中，讓其成長為一個新的單細胞克隆。在目前的干細胞培養方法下，單個干細胞能夠成功成長為單細胞克隆的機會非常小。這常常成為干細胞基因編輯的路障。在發現Chroman1和Emricasan（C+E）的協同作用后，作者在干細胞單細胞克隆實驗中測試了C+E的效果。作者吃驚的發現C+E并不能夠提高干細胞單細胞克隆的效率。這個結果讓作者認識到干細胞在單細胞克隆過程中面臨著細胞低密度條件下特殊的生存壓力。為了尋找能夠緩解這種特殊壓力的化合物，作者進一步發展了在低細胞密度下進行藥物高通量篩選的實驗體系。通過在低細胞密度下進行第三輪藥物高通量篩選，作者非常幸運地發現tISRIB可以顯著增加干細胞在低密度條件下的存活率。tISRIB 是University of California, San Francisco (UCSF) Peter Walter實驗室研發的Integrated Stress Response的抑制劑。因此，這一研究發現表明Integrated Stress Response在干細胞的存活中有著重要作用。同時，通過測試多種細胞培養添加組分作者也發現polyamines也可以促進干細胞在單細胞克隆過程中的存活。最終，作者發現同時使用Chroman1, Emricasan, polyamines, 和tISRIB（CEPT）可以將干細胞的單細胞克隆率提升到40%以上。

在提升了人源干細胞的單細胞克隆效率之后，作者測試了CEPT在干細胞培養中的其他運用。他們發現CEPT不僅可以減少干細胞在形成EB過程中的凋亡，而且可以促進EB和微器官的生長和分化。同時，CEPT也可以極大的減少干細胞以及干細胞產品在凍存復蘇過程中的凋亡。因此，CEPT在人源干細胞的基礎研究和臨床運用中都有廣闊的運用前景。

圖4. CEPT促進干細胞在Embryoid body和凍存復蘇過程中的存活

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參考文獻
1. Tsujimoto H, Osafune K. Current status and future directions of clinical applications using iPS cells-focus on Japan. FEBS J. 2022;289(23):7274-7291.

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