植物抗逆性文獻解讀：干旱脅迫下的作物DNA甲基化動態變化
干旱（Drought）會對植物的生長、發育和生產力造成嚴重損害，是最具危害性的環境因素之一。植物已經進化出復雜的調控網絡和干旱脅迫的抗性策略。作為一種保守的表觀遺傳調控，DNA甲基化變化可以改變植物對非生物脅迫響應中的基因表達和染色體互作。基因組學、表觀基因組學和轉錄組學等組學技術的發展促進了非模式作物物種表觀遺傳變異研究的快速增長。本文總結了干旱脅迫下作物DNA甲基化作用的最新研究成果，包括甲基化和去甲基化酶、整體甲基化動態變化、DNA甲基化對基因表達的雙重調控、RNA依賴性DNA甲基化(RdDM)通路、可變剪接(AS)事件和長鏈非編碼RNAs(lnc RNAs)。還討論了干旱誘導的逆境脅迫記憶（stress memory）。這些表觀基因組研究結果為制定提高作物抗旱性策略提供了寶貴的潛力。
干旱脅迫導致細胞膨壓下降，導致細胞壁的組成和結構發生變化，以及對質膜和細胞壁造成損傷。滲透傳感器，如組氨酸激酶（HKs）、DROOPY LEAF1（DPY1）、滲透敏感性Ca2+通道減少HYPEROSMOLALITY-INDUCED CA 2+ INCREASE1（OSCA1）、鈣離子滲透性應激門控陽離子通道1（CSC1）和MID1互補活性（MCAs），能夠感知干旱脅迫對植物細胞的影響（圖1）。隨后，各種信號通路被激活，包括鈣信號、ABA依賴性和ABA非依賴性信號以及活性氧（ROS）。轉錄、轉錄后、翻譯后和表觀遺傳學水平的多個調控過程被整合到植物對干旱的響應中。近期文獻全面綜述了干旱脅迫感知和信號通路的分子機制。
圖1：滲透傳感器介導干旱脅迫信號。MCA、OSCA1和CSC1是 Ca2+ 通道，其在干旱脅迫下被激活，導致胞質鈣離子 （Ca2+） 增加。鈣依賴性蛋白激酶 （CPK） 可感知胞質溶膠中升高的Ca2+水平，并啟動下游信號級聯反應。在干旱脅迫下，DROOPY LEAF1（DPY1）被磷酸化，導致多種蛋白質的全局磷酸化，包括STRESS ACTIVATED PROTEIN KINASE6（SAPK6）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）、鈣依賴性蛋白激酶（CDPKs）和Raf樣激酶（RAFs）。位于質膜上的組氨酸激酶 （HKs） 也參與 MAPK 信號通路。
DNA甲基轉移酶和去甲基化酶在抗旱性中的應用
通過精確調控維持DNA甲基化和去甲基化的動態平衡對于各種細胞生物過程至關重要。多種不同的酶已被鑒定出能激活或失活特定的DNA甲基化狀態。在擬南芥中，CG、CHG和CHH胞嘧啶甲基化分別優先由甲基轉移酶1（MET1）、染色體甲基轉移酶3（CMT3）和結構重排甲基轉移酶2（DRM2）催化。DNA去甲基化由四種DNA糖苷酶家族執行，包括沉默抑制因子1（ROS1）、轉錄激活因子DEMETER（DME）、類似DEMETER蛋白2（DML2）和DML3。核小體重塑因子REDUCED IN DNA METHYLIZATION 1（DDM1）在維持轉座元件的DNA甲基化中起著關鍵作用。
在作物中已鑒定并功能表征了DNA甲基轉移酶和去甲基化酶基團。在水稻中共鑒定出九種DNA甲基轉移酶（1種MET、3種CMT和2種DRM）。與擬南芥相比，MET和DRM家族的基因數量重復。與擬南芥同源物類似，OsMET1b、OsCMT3a和OsDRM2分別是CG、CHG和CHH甲基化的主要甲基轉移酶。在CMT2中觀察到輕微差異，不影響水稻中的CHG甲基化，但在擬南芥中維持CHH和CHG甲基化。表明在擬南芥和作物中存在保守的DNA甲基化機制。
基因表達分析表明，干旱脅迫改變了編碼DNA甲基轉移酶和去甲基化酶的基因轉錄水平。在蘋果和桑樹中，不同時間點的干旱脅迫下觀察到DNA甲基轉移酶和去甲基化酶基因之間的節律表達，表明DNA甲基化和去甲基化之間的協調響應。
抑制DNA甲基轉移酶可能激活應激響應的基因表達。擬南芥中的cmt2和drm2突變體分別表現出對熱應激和冷應激的抗性增加。5-氮雜胞苷（DNA甲基轉移酶抑制劑）的應用增強了擬南芥的抗凍性。同樣，楊樹RNAi系中核小體重塑因子DDM1下調通過調控參與激素相關應激響應基因，顯示出對干旱誘導的空化具有更高的抗性。注射DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷的棉花植物也表現出改善的抗旱性。
干旱脅迫下的甲基化譜
植物界中的DNA甲基化水平各不相同。研究發現DNA甲基化水平（CG和CHG）與基因組大小之間正相關。由于不同物種間甲基化區域的大小和水平存在差異，干旱脅迫對DNA甲基化模式的影響也因物種而異。在比較干旱脅迫下的甲基化組時，發現擬南芥的整體甲基化水平保持不變；桑樹、亞麻和毛果松（P. trichocarpa）中增加；而在蠶豆、多年生黑麥草和毛白楊（P. tomentosa）中顯著減少。此外，在水稻、玉米、豇豆、小麥和P. tomentosa中，干旱脅迫誘導的甲基化水平在干旱敏感型品系中比抗旱型品系中更高，表明DNA甲基化與干旱抗性之間存在負相關。 在三種DNA甲基化環境中，CHH甲基化水平在大多數作物中與干旱脅迫的相關性最高。但在桑樹中，CG甲基化水平與干旱脅迫的相關性更高。此外，干旱誘導的CHH甲基化變化主要發生在轉座元件序列和/或基因啟動子區域。
DNA甲基化與基因表達的相關性
DNA甲基化在不同基因組區域的作用各不相同。基因啟動子附近的甲基化通常通過抑制轉錄因子結合以抑制基因表達。也有大量例外表明啟動子甲基化與基因表達之間存在復雜的關系。基因體（Genebody）區DNA甲基化可能與轉錄延伸、可變剪接以及重復DNA元件抑制有關。通過對轉錄組和甲基化組數據的綜合分析，揭示了在干旱脅迫下，擬南芥和其他作物中DNA甲基化密度與基因表達水平之間相對保守的關系。通常，基因表達水平與基因體甲基化水平（尤其是在CG環境中）和/或遠端啟動子區域（尤其是在CHH環境中）呈正相關，但與轉錄起始位點(TSS)、轉錄終止位點(TTS)和下游區域的甲基化密度呈負相關。轉座元件(TE)區域高甲基化可能有助于轉座子抑制，且附近TE基因表達水平可能會受到影響。
干旱脅迫誘導的差異甲基化區域在決定應激響應基因的表達水平中發揮重要作用。利用WGBS和RNA-seq技術鑒定出基因表達水平與DNA甲基化相關的候選基因組。其中許多基因在應激響應通路中富集，如激素信號通路、轉錄因子、程序性細胞死亡和ROS合成。具體來說，干旱脅迫下CHH變化有助于提高與干旱相關轉錄因子表達，包括AP2、WRKY、MYB、NAC和bHLH轉錄因子家族成員。
多個關鍵基因已被鑒定出與DNA甲基化、轉錄表達和干旱抗性相關。例如在玉米中，ZmNAC111啟動子上的DNA甲基化水平增加導致其表達減少并增加干旱敏感性。大麥中HvCKX2.1啟動子甲基化由干旱脅迫誘導，并加速大麥嫩芽出苗。此外，蘋果中MdRFNR1（蘋果抗旱性的正調控因子）表達由其啟動子中的MITE插入位點的甲基化誘導。
RNA依賴性DNA甲基化通路
RNA定向DNA甲基化(RdDM)通路是植物中一種獨特過程，非編碼RNA以序列特異性方式啟動de novo DNA甲基化。擬南芥中鑒定的典型RdDM通路產生24個小干擾RNA(siRNAs)，這些siRNA與DNA甲基化酶互作以建立de novo DNA甲基化(圖2)。siRNA前體最初由RNA聚合酶IV(POL IV)產生，并通過RNA依賴性RNA聚合酶2(RDR2)轉化為雙鏈RNA(dsRNA)。然后，dsRNAs通過Dicer樣蛋白3(DCL3)片段化成24-nt siRNAs，并加載到Argonaute 4(AGO4)和AGO6蛋白上。由POL V轉錄的Scaffold RNAs 與24-nt siRNAs互補，并在靶位點被DRM2 de novo甲基化。該過程中需要許多輔助蛋白，POL IV、Sawadee同源結構域蛋白1(SHH1)和SNF2結構域含有蛋白Classy 1(CLSY1)（染色質重塑蛋白）互作；而SHH1與二甲基化組蛋白H3賴氨酸9(H3K9me2) 結合。RNA定向DNA甲基化3(RDM3)是POL V的轉錄延伸因子，增強AGO4/6和POL V互作。由RNA定向DNA甲基化缺失1(DRD1)、分生組織沉默缺失3(DMS3)和RDM1組裝的DDR復合體，需要進行染色質重塑以促進POL V。RDM1通過與AGO4和DRM2互作，在de novo DNA甲基化反應中發揮關鍵作用。Variegation 3-9同源蛋白2(SUVH2)和SUVH9通過鑒定甲基化胞嘧啶并與DDR復合體互作，有助于在正確位置招募POL V。
RdDM通路主要通過在新TE插入位點上進行de novo DNA甲基化以及維持現有TEs上穩定甲基化來抑制TE表達。RdDM通路增強了非生物脅迫下被激活的TEs活性，如番茄中一個Rider逆轉錄轉座子TE家族在干旱脅迫下被激活，并通過RdDM通路調控。RdDM通路還與玉米中ZmNAC111、大麥中HvCKX2.1、蘋果中MdRFNR1的啟動子區域的TE元件甲基化有關。水稻和玉米中干旱誘導的siRNA豐度和DNA甲基化在不同的遺傳區域顯示出正相關。這些結果表明RdDM通路參與作物對干旱脅迫的響應。
干旱脅迫下DNA甲基化調控的可變剪接
近期證據表明DNA甲基化在調控可變剪接（selective spending，AS）中的作用，部分是通過在可變剪接外顯子上的甲基化狀態變化。AS是一個能夠從單基因生成多種轉錄本異構體的重要機制，它作為基本的轉錄后調控過程，影響特定異構體的穩定性、表達或亞細胞定位。約42%~61%的植物基因會經歷可變剪接，AS有助于植物發育的各個方面的轉錄組重編程，包括種子萌發、開花和生物鐘。植物AS在獲得非生物脅迫抗性中也起著至關重要的作用，尤其在ABA信號介導的干旱抗性中。
基因可以經歷兩種類型的AS，經典和可變順式剪接（cis-splicing，順式剪接），以及遺傳和自我反式剪接（trans-splicing，反式剪接）。AS事件由細胞核中的剪接復合體執行，而剪接因子（如絲氨酸/精氨酸（SR）蛋白的成員則促進了這一復合體。三種激酶包括：絲氨酸/精氨酸蛋白激酶(SRPKs)、Pre-mRNA加工因子4(PRP4Ks)激酶和擬南芥FUS3補充因子(AFC)，已被確認對剪接體形成和剪接位點鑒定至關重要。這些與剪接相關的激酶在擬南芥、水稻和小麥中的不同表達在非生物脅迫下表明其參與脅迫響應。
與側翼內含子相比，外顯子上的DNA甲基化水平更高。因此，基因體DNA甲基化水平差異分布被視為區分外顯子和內含子的標記。DNA甲基化可以影響外顯子選擇和Pre-mRNA的可變剪接。然而，DNA甲基化與AS事件之間的關系在不同作物的干旱脅迫下有顯著差異。玉米基因體DNA甲基化水平與AS事件呈正相關，但與基因表達呈負相關，表明DNA甲基化在響應干旱脅迫時對基因表達和AS具有雙重調控作用。亞麻品種中，AS事件在干旱脅迫下迅速積聚，但與基因體甲基化動態無關。在P. trichocarpa中，由于大多數順式剪接基因中缺少甲基化位點，未發現甲基化與順式剪接事件之間的關系，表明作物中可變剪接的調控機制不同。
當前對AS與DNA甲基化之間關聯的理解僅限于第二代測序技術，這些技術產生短讀長，可能無法準確預測AS。最近第三代測序技術的進步，提供了更長讀長以直接檢測轉錄本異構體的表觀遺傳修飾，將為作物非生物脅迫下AS的表觀遺傳調控提供寶貴見解。
干旱脅迫下長鏈非編碼RNAs和DNA甲基化
長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNAs）是一類長度超過200 nt的RNA轉錄本，不會被翻譯成功能性蛋白。它們可以影響細胞質mRNA穩定性，并調控mRNA加工的不同階段，如剪接、轉運和翻譯。植物lncRNAs參與基本的生物過程，包括春化、生育、光合作用通路和生物/非生物脅迫響應，主要依賴于其組織和條件特異性表達模式。研究表明，在擬南芥、玉米和桑樹中，許多lncRNA表達可以響應干旱脅迫。
最近的研究揭示了DNA甲基化與lncRNA互作。lncRNA表達水平在所有三種序列環境中都受DNA甲基化負調控，包括其側翼和body區域。LncRNA還通過與DNA甲基轉移酶互作，在基因啟動子中介導DNA甲基化，從而在表觀遺傳學水平上調控基因表達。
在作物中已經觀察到干旱條件下lncRNAs和DNA甲基化的參與。在棉花中，lncRNA可能會剪接成microRNA，microRNAs在干旱脅迫下調控甲基化。在水稻中，lncRNA和DNA甲基化可能通過激活與抗旱能力相關的基因來建立短期干旱應激的記憶因子。需要進一步研究來揭示表觀遺傳學和lncRNA調控的詳細機制。
干旱應激記憶
植物已經進化出一種機制來獲取對環境經歷的記憶，促進植物適應反復出現的應激。表觀遺傳應激記憶被定義為由環境輸入誘導特定位點上的染色質標記，并可以在未來相同應激下通過細胞分裂傳遞。這些由環境觸發的表觀遺傳標記包括核小體組蛋白的翻譯后修飾（如乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化）以及應激響應位點上的DNA甲基化或去甲基化，如組蛋白H3賴氨酸-4三甲基化(H3K4me3)和組蛋白H3賴氨酸-27三甲基化(H3K27me3)通常分別與基因激活和抑制相關。
植物通過瞬時生物或非生物脅迫而被"啟動"，并在一段時間內存儲應激記憶，以便在脅迫再次發生時做出更快速和有力響應。染色質介導的環境記憶分為體細胞記憶（somatic memory）和傳代記憶（transgenerational memory）（圖3）。逆境響應通過有絲分裂傳遞給新生細胞，形成體細胞逆境記憶；通過減數分裂傳遞給下一代植株，即使后代沒有受到逆境影響，形成傳代記憶。體細胞記憶通常與啟動期間的組蛋白H3K4甲基化和核小體占位有關。如在復水處理（re-water treatment）后維持兩個干旱誘導基因(RB29B和RAB18)的H3K4me3對干旱脅迫啟動至關重要。
代際或傳代脅迫記憶機制遠未明確，不同DNA甲基化的表觀遺傳變異可能參與染色質應激記憶遺傳。在擬南芥中，DNA甲基化的表觀遺傳改變可以跨代遺傳，但DNA甲基化狀態在六代內的連續代中主要是穩定的，且對反復干旱脅迫不敏感。在五個擬南芥品系中，在輕度干旱下沒有發現跨代效應或遺傳的應激記憶。相比之下，水稻在反復干旱脅迫和恢復處理下，鑒定出與DNA甲基化相關的短期應激記憶建立。此外在水稻和玉米中，干旱抗性品系比干旱敏感品系在水分虧缺脅迫下的DNA甲基化組的穩定性和遺傳性更高。這引發了一個問題，即干旱誘導的DNA甲基化變異如何支撐跨代應激記憶。對白三葉草和草莓的最新研究表明，環境互作介導的部分效應可以遺傳，且種群歷史有助于適應干旱的穩定表觀遺傳記憶形成。
結論與未來展望
本文總結了不同作物在干旱脅迫下DNA甲基化的最新研究（表1），并提供了對干旱脅迫下表觀遺傳響應的見解（圖4）。干旱脅迫引起的DNA甲基化變化以物種、基因型和組織特異性的方式存在差異。在三種DNA甲基化環境中，不對稱的CHH對干旱脅迫高度敏感。大多數現有研究表明DNA甲基化在調控應激響應基因表達中起著重要作用。此外RdDM DNA甲基化可能靶向轉座元件(TEs)和基因，以序列特異性的方式在響應干旱脅迫時沉默。在一些作物中，可變剪接(AS)事件和長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在應激響應中發揮關鍵作用，可能與干旱脅迫下的DNA甲基化有關。然而，需要進一步探索非生物脅迫下AS事件和lncRNAs的表觀遺傳調控。
圖4：DNA甲基化在植物干旱脅迫響應中的作用。
植物基因組中DNA甲基化的位點特異性操作有幾種方法可用。其中一種方法是病毒誘導基因沉默(VIGS)技術，該技術可以通過siRNAs激活RdDM通路以沉默基因表達。然而傳統的表觀遺傳修飾方法可能導致DNA甲基化整體變化。近年來表觀基因組編輯技術已成功應用于精確染色質擾動，如Tet1或Dnmt3a與催化失活的dCas9融合蛋白已被證明可以調節靶向報告基因啟動子區域的甲基化狀態。已經開發出一套由催化失活dCas9與優化GCN4尾部融合的表觀基因組編輯工具，以及包含九種效應子的文庫，用于特定位點的系統性染色質修飾。這些新興的表觀遺傳修飾技術將為作物的表觀遺傳操作提供機會，以改善農藝性狀。
全球變暖和降雨量減少等氣候變化加速了干旱脅迫的普遍性。迫切需要開發能夠適應不可預測極端天氣條件的氣候彈性作物。表觀遺傳變異是可遺傳變化，使植物能夠在不改變DNA序列的情況下響應環境脅迫。了解表觀遺傳變化與適應干旱脅迫之間的聯系將促進重要作物的分子育種。應將表觀基因組視為一個整體系統，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA介導的基因沉默。隨著高通量技術的發展，如第二代和第三代測序、RNA和染色質免疫沉淀(ChIP)測序以及單細胞測序，將更容易繪制出干旱脅迫響應的單細胞分辨率的表觀基因組譜。未來發展表觀遺傳修飾技術并深化對表觀遺傳機制的理解，將為培育具有遺傳性和穩定性以增強抗逆性的作物提供有希望的方法。
參考文獻：
Rao X, Yang S, Lü S, Yang P. DNA Methylation Dynamics in Response to Drought Stress in Crops. Plants (Basel). 2024 Jul 19;13(14) pii: plants13141977. doi: 10.3390/plants13141977. PubMed PMID: 39065503.
干旱脅迫導致細胞膨壓下降，導致細胞壁的組成和結構發生變化，以及對質膜和細胞壁造成損傷。滲透傳感器，如組氨酸激酶（HKs）、DROOPY LEAF1（DPY1）、滲透敏感性Ca2+通道減少HYPEROSMOLALITY-INDUCED CA 2+ INCREASE1（OSCA1）、鈣離子滲透性應激門控陽離子通道1（CSC1）和MID1互補活性（MCAs），能夠感知干旱脅迫對植物細胞的影響（圖1）。隨后，各種信號通路被激活，包括鈣信號、ABA依賴性和ABA非依賴性信號以及活性氧（ROS）。轉錄、轉錄后、翻譯后和表觀遺傳學水平的多個調控過程被整合到植物對干旱的響應中。近期文獻全面綜述了干旱脅迫感知和信號通路的分子機制。
DNA甲基轉移酶和去甲基化酶在抗旱性中的應用
通過精確調控維持DNA甲基化和去甲基化的動態平衡對于各種細胞生物過程至關重要。多種不同的酶已被鑒定出能激活或失活特定的DNA甲基化狀態。在擬南芥中，CG、CHG和CHH胞嘧啶甲基化分別優先由甲基轉移酶1（MET1）、染色體甲基轉移酶3（CMT3）和結構重排甲基轉移酶2（DRM2）催化。DNA去甲基化由四種DNA糖苷酶家族執行，包括沉默抑制因子1（ROS1）、轉錄激活因子DEMETER（DME）、類似DEMETER蛋白2（DML2）和DML3。核小體重塑因子REDUCED IN DNA METHYLIZATION 1（DDM1）在維持轉座元件的DNA甲基化中起著關鍵作用。
在作物中已鑒定并功能表征了DNA甲基轉移酶和去甲基化酶基團。在水稻中共鑒定出九種DNA甲基轉移酶（1種MET、3種CMT和2種DRM）。與擬南芥相比，MET和DRM家族的基因數量重復。與擬南芥同源物類似，OsMET1b、OsCMT3a和OsDRM2分別是CG、CHG和CHH甲基化的主要甲基轉移酶。在CMT2中觀察到輕微差異，不影響水稻中的CHG甲基化，但在擬南芥中維持CHH和CHG甲基化。表明在擬南芥和作物中存在保守的DNA甲基化機制。
基因表達分析表明，干旱脅迫改變了編碼DNA甲基轉移酶和去甲基化酶的基因轉錄水平。在蘋果和桑樹中，不同時間點的干旱脅迫下觀察到DNA甲基轉移酶和去甲基化酶基因之間的節律表達，表明DNA甲基化和去甲基化之間的協調響應。
抑制DNA甲基轉移酶可能激活應激響應的基因表達。擬南芥中的cmt2和drm2突變體分別表現出對熱應激和冷應激的抗性增加。5-氮雜胞苷（DNA甲基轉移酶抑制劑）的應用增強了擬南芥的抗凍性。同樣，楊樹RNAi系中核小體重塑因子DDM1下調通過調控參與激素相關應激響應基因，顯示出對干旱誘導的空化具有更高的抗性。注射DNA甲基化抑制劑5-氮雜胞苷的棉花植物也表現出改善的抗旱性。
干旱脅迫下的甲基化譜
植物界中的DNA甲基化水平各不相同。研究發現DNA甲基化水平（CG和CHG）與基因組大小之間正相關。由于不同物種間甲基化區域的大小和水平存在差異，干旱脅迫對DNA甲基化模式的影響也因物種而異。在比較干旱脅迫下的甲基化組時，發現擬南芥的整體甲基化水平保持不變；桑樹、亞麻和毛果松（P. trichocarpa）中增加；而在蠶豆、多年生黑麥草和毛白楊（P. tomentosa）中顯著減少。此外，在水稻、玉米、豇豆、小麥和P. tomentosa中，干旱脅迫誘導的甲基化水平在干旱敏感型品系中比抗旱型品系中更高，表明DNA甲基化與干旱抗性之間存在負相關。 在三種DNA甲基化環境中，CHH甲基化水平在大多數作物中與干旱脅迫的相關性最高。但在桑樹中，CG甲基化水平與干旱脅迫的相關性更高。此外，干旱誘導的CHH甲基化變化主要發生在轉座元件序列和/或基因啟動子區域。
DNA甲基化與基因表達的相關性
DNA甲基化在不同基因組區域的作用各不相同。基因啟動子附近的甲基化通常通過抑制轉錄因子結合以抑制基因表達。也有大量例外表明啟動子甲基化與基因表達之間存在復雜的關系。基因體（Genebody）區DNA甲基化可能與轉錄延伸、可變剪接以及重復DNA元件抑制有關。通過對轉錄組和甲基化組數據的綜合分析，揭示了在干旱脅迫下，擬南芥和其他作物中DNA甲基化密度與基因表達水平之間相對保守的關系。通常，基因表達水平與基因體甲基化水平（尤其是在CG環境中）和/或遠端啟動子區域（尤其是在CHH環境中）呈正相關，但與轉錄起始位點(TSS)、轉錄終止位點(TTS)和下游區域的甲基化密度呈負相關。轉座元件(TE)區域高甲基化可能有助于轉座子抑制，且附近TE基因表達水平可能會受到影響。
干旱脅迫誘導的差異甲基化區域在決定應激響應基因的表達水平中發揮重要作用。利用WGBS和RNA-seq技術鑒定出基因表達水平與DNA甲基化相關的候選基因組。其中許多基因在應激響應通路中富集，如激素信號通路、轉錄因子、程序性細胞死亡和ROS合成。具體來說，干旱脅迫下CHH變化有助于提高與干旱相關轉錄因子表達，包括AP2、WRKY、MYB、NAC和bHLH轉錄因子家族成員。
多個關鍵基因已被鑒定出與DNA甲基化、轉錄表達和干旱抗性相關。例如在玉米中，ZmNAC111啟動子上的DNA甲基化水平增加導致其表達減少并增加干旱敏感性。大麥中HvCKX2.1啟動子甲基化由干旱脅迫誘導，并加速大麥嫩芽出苗。此外，蘋果中MdRFNR1（蘋果抗旱性的正調控因子）表達由其啟動子中的MITE插入位點的甲基化誘導。
RNA依賴性DNA甲基化通路
RNA定向DNA甲基化(RdDM)通路是植物中一種獨特過程，非編碼RNA以序列特異性方式啟動de novo DNA甲基化。擬南芥中鑒定的典型RdDM通路產生24個小干擾RNA(siRNAs)，這些siRNA與DNA甲基化酶互作以建立de novo DNA甲基化(圖2)。siRNA前體最初由RNA聚合酶IV(POL IV)產生，并通過RNA依賴性RNA聚合酶2(RDR2)轉化為雙鏈RNA(dsRNA)。然后，dsRNAs通過Dicer樣蛋白3(DCL3)片段化成24-nt siRNAs，并加載到Argonaute 4(AGO4)和AGO6蛋白上。由POL V轉錄的Scaffold RNAs 與24-nt siRNAs互補，并在靶位點被DRM2 de novo甲基化。該過程中需要許多輔助蛋白，POL IV、Sawadee同源結構域蛋白1(SHH1)和SNF2結構域含有蛋白Classy 1(CLSY1)（染色質重塑蛋白）互作；而SHH1與二甲基化組蛋白H3賴氨酸9(H3K9me2) 結合。RNA定向DNA甲基化3(RDM3)是POL V的轉錄延伸因子，增強AGO4/6和POL V互作。由RNA定向DNA甲基化缺失1(DRD1)、分生組織沉默缺失3(DMS3)和RDM1組裝的DDR復合體，需要進行染色質重塑以促進POL V。RDM1通過與AGO4和DRM2互作，在de novo DNA甲基化反應中發揮關鍵作用。Variegation 3-9同源蛋白2(SUVH2)和SUVH9通過鑒定甲基化胞嘧啶并與DDR復合體互作，有助于在正確位置招募POL V。
圖2：擬南芥中典型的RNA定向DNA甲基化通路。
RdDM通路主要通過在新TE插入位點上進行de novo DNA甲基化以及維持現有TEs上穩定甲基化來抑制TE表達。RdDM通路增強了非生物脅迫下被激活的TEs活性，如番茄中一個Rider逆轉錄轉座子TE家族在干旱脅迫下被激活，并通過RdDM通路調控。RdDM通路還與玉米中ZmNAC111、大麥中HvCKX2.1、蘋果中MdRFNR1的啟動子區域的TE元件甲基化有關。水稻和玉米中干旱誘導的siRNA豐度和DNA甲基化在不同的遺傳區域顯示出正相關。這些結果表明RdDM通路參與作物對干旱脅迫的響應。
干旱脅迫下DNA甲基化調控的可變剪接
近期證據表明DNA甲基化在調控可變剪接（selective spending，AS）中的作用，部分是通過在可變剪接外顯子上的甲基化狀態變化。AS是一個能夠從單基因生成多種轉錄本異構體的重要機制，它作為基本的轉錄后調控過程，影響特定異構體的穩定性、表達或亞細胞定位。約42%~61%的植物基因會經歷可變剪接，AS有助于植物發育的各個方面的轉錄組重編程，包括種子萌發、開花和生物鐘。植物AS在獲得非生物脅迫抗性中也起著至關重要的作用，尤其在ABA信號介導的干旱抗性中。
基因可以經歷兩種類型的AS，經典和可變順式剪接（cis-splicing，順式剪接），以及遺傳和自我反式剪接（trans-splicing，反式剪接）。AS事件由細胞核中的剪接復合體執行，而剪接因子（如絲氨酸/精氨酸（SR）蛋白的成員則促進了這一復合體。三種激酶包括：絲氨酸/精氨酸蛋白激酶(SRPKs)、Pre-mRNA加工因子4(PRP4Ks)激酶和擬南芥FUS3補充因子(AFC)，已被確認對剪接體形成和剪接位點鑒定至關重要。這些與剪接相關的激酶在擬南芥、水稻和小麥中的不同表達在非生物脅迫下表明其參與脅迫響應。
與側翼內含子相比，外顯子上的DNA甲基化水平更高。因此，基因體DNA甲基化水平差異分布被視為區分外顯子和內含子的標記。DNA甲基化可以影響外顯子選擇和Pre-mRNA的可變剪接。然而，DNA甲基化與AS事件之間的關系在不同作物的干旱脅迫下有顯著差異。玉米基因體DNA甲基化水平與AS事件呈正相關，但與基因表達呈負相關，表明DNA甲基化在響應干旱脅迫時對基因表達和AS具有雙重調控作用。亞麻品種中，AS事件在干旱脅迫下迅速積聚，但與基因體甲基化動態無關。在P. trichocarpa中，由于大多數順式剪接基因中缺少甲基化位點，未發現甲基化與順式剪接事件之間的關系，表明作物中可變剪接的調控機制不同。
當前對AS與DNA甲基化之間關聯的理解僅限于第二代測序技術，這些技術產生短讀長，可能無法準確預測AS。最近第三代測序技術的進步，提供了更長讀長以直接檢測轉錄本異構體的表觀遺傳修飾，將為作物非生物脅迫下AS的表觀遺傳調控提供寶貴見解。
干旱脅迫下長鏈非編碼RNAs和DNA甲基化
長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA， lncRNAs）是一類長度超過200 nt的RNA轉錄本，不會被翻譯成功能性蛋白。它們可以影響細胞質mRNA穩定性，并調控mRNA加工的不同階段，如剪接、轉運和翻譯。植物lncRNAs參與基本的生物過程，包括春化、生育、光合作用通路和生物/非生物脅迫響應，主要依賴于其組織和條件特異性表達模式。研究表明，在擬南芥、玉米和桑樹中，許多lncRNA表達可以響應干旱脅迫。
最近的研究揭示了DNA甲基化與lncRNA互作。lncRNA表達水平在所有三種序列環境中都受DNA甲基化負調控，包括其側翼和body區域。LncRNA還通過與DNA甲基轉移酶互作，在基因啟動子中介導DNA甲基化，從而在表觀遺傳學水平上調控基因表達。
在作物中已經觀察到干旱條件下lncRNAs和DNA甲基化的參與。在棉花中，lncRNA可能會剪接成microRNA，microRNAs在干旱脅迫下調控甲基化。在水稻中，lncRNA和DNA甲基化可能通過激活與抗旱能力相關的基因來建立短期干旱應激的記憶因子。需要進一步研究來揭示表觀遺傳學和lncRNA調控的詳細機制。
干旱應激記憶
植物已經進化出一種機制來獲取對環境經歷的記憶，促進植物適應反復出現的應激。表觀遺傳應激記憶被定義為由環境輸入誘導特定位點上的染色質標記，并可以在未來相同應激下通過細胞分裂傳遞。這些由環境觸發的表觀遺傳標記包括核小體組蛋白的翻譯后修飾（如乙酰化、甲基化、磷酸化和泛素化）以及應激響應位點上的DNA甲基化或去甲基化，如組蛋白H3賴氨酸-4三甲基化(H3K4me3)和組蛋白H3賴氨酸-27三甲基化(H3K27me3)通常分別與基因激活和抑制相關。
植物通過瞬時生物或非生物脅迫而被"啟動"，并在一段時間內存儲應激記憶，以便在脅迫再次發生時做出更快速和有力響應。染色質介導的環境記憶分為體細胞記憶（somatic memory）和傳代記憶（transgenerational memory）（圖3）。逆境響應通過有絲分裂傳遞給新生細胞，形成體細胞逆境記憶；通過減數分裂傳遞給下一代植株，即使后代沒有受到逆境影響，形成傳代記憶。體細胞記憶通常與啟動期間的組蛋白H3K4甲基化和核小體占位有關。如在復水處理（re-water treatment）后維持兩個干旱誘導基因(RB29B和RAB18)的H3K4me3對干旱脅迫啟動至關重要。
圖3：植物中基于表觀遺傳學和染色質的脅迫記憶。
植物在最初的脅迫暴露后獲得應激記憶（priming），可以增強其對后續脅迫的抗性。體細胞脅迫記憶是暫時性的。在體細胞脅迫記憶中表現出H3K4高甲基化、轉錄記憶、核小體重塑和核小體占有以響應非生物脅迫。傳代脅迫記憶會傳遞給無脅迫的后代植株，不同 DNA 甲基化的可遺傳表觀等位基因可能參與染色質傳代應激記憶機制。代際或傳代脅迫記憶機制遠未明確，不同DNA甲基化的表觀遺傳變異可能參與染色質應激記憶遺傳。在擬南芥中，DNA甲基化的表觀遺傳改變可以跨代遺傳，但DNA甲基化狀態在六代內的連續代中主要是穩定的，且對反復干旱脅迫不敏感。在五個擬南芥品系中，在輕度干旱下沒有發現跨代效應或遺傳的應激記憶。相比之下，水稻在反復干旱脅迫和恢復處理下，鑒定出與DNA甲基化相關的短期應激記憶建立。此外在水稻和玉米中，干旱抗性品系比干旱敏感品系在水分虧缺脅迫下的DNA甲基化組的穩定性和遺傳性更高。這引發了一個問題，即干旱誘導的DNA甲基化變異如何支撐跨代應激記憶。對白三葉草和草莓的最新研究表明，環境互作介導的部分效應可以遺傳，且種群歷史有助于適應干旱的穩定表觀遺傳記憶形成。
結論與未來展望
本文總結了不同作物在干旱脅迫下DNA甲基化的最新研究（表1），并提供了對干旱脅迫下表觀遺傳響應的見解（圖4）。干旱脅迫引起的DNA甲基化變化以物種、基因型和組織特異性的方式存在差異。在三種DNA甲基化環境中，不對稱的CHH對干旱脅迫高度敏感。大多數現有研究表明DNA甲基化在調控應激響應基因表達中起著重要作用。此外RdDM DNA甲基化可能靶向轉座元件(TEs)和基因，以序列特異性的方式在響應干旱脅迫時沉默。在一些作物中，可變剪接(AS)事件和長鏈非編碼RNAs(lncRNAs)在應激響應中發揮關鍵作用，可能與干旱脅迫下的DNA甲基化有關。然而，需要進一步探索非生物脅迫下AS事件和lncRNAs的表觀遺傳調控。
圖4：DNA甲基化在植物干旱脅迫響應中的作用。
植物基因組中DNA甲基化的位點特異性操作有幾種方法可用。其中一種方法是病毒誘導基因沉默(VIGS)技術，該技術可以通過siRNAs激活RdDM通路以沉默基因表達。然而傳統的表觀遺傳修飾方法可能導致DNA甲基化整體變化。近年來表觀基因組編輯技術已成功應用于精確染色質擾動，如Tet1或Dnmt3a與催化失活的dCas9融合蛋白已被證明可以調節靶向報告基因啟動子區域的甲基化狀態。已經開發出一套由催化失活dCas9與優化GCN4尾部融合的表觀基因組編輯工具，以及包含九種效應子的文庫，用于特定位點的系統性染色質修飾。這些新興的表觀遺傳修飾技術將為作物的表觀遺傳操作提供機會，以改善農藝性狀。
全球變暖和降雨量減少等氣候變化加速了干旱脅迫的普遍性。迫切需要開發能夠適應不可預測極端天氣條件的氣候彈性作物。表觀遺傳變異是可遺傳變化，使植物能夠在不改變DNA序列的情況下響應環境脅迫。了解表觀遺傳變化與適應干旱脅迫之間的聯系將促進重要作物的分子育種。應將表觀基因組視為一個整體系統，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA介導的基因沉默。隨著高通量技術的發展，如第二代和第三代測序、RNA和染色質免疫沉淀(ChIP)測序以及單細胞測序，將更容易繪制出干旱脅迫響應的單細胞分辨率的表觀基因組譜。未來發展表觀遺傳修飾技術并深化對表觀遺傳機制的理解，將為培育具有遺傳性和穩定性以增強抗逆性的作物提供有希望的方法。
參考文獻：
Rao X, Yang S, Lü S, Yang P. DNA Methylation Dynamics in Response to Drought Stress in Crops. Plants (Basel). 2024 Jul 19;13(14) pii: plants13141977. doi: 10.3390/plants13141977. PubMed PMID: 39065503.
標簽：
DNA甲基化
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