新版指南解讀：TBNK性能驗證及室內(nèi)質(zhì)控怎么做？
淋巴細(xì)胞亞群中的T細(xì)胞、B細(xì)胞和自然殺傷（NK）細(xì)胞，即TBNK 淋巴細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，檢測其水平變化能提示機(jī)體免疫狀態(tài)的改變。TBNK 淋巴細(xì)胞檢測已全面應(yīng)用于艾滋病、嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）、慢性乙型肝炎、手足口病、Epstein-Barr 病毒（EBV）感染、流行性出血熱等多種感染性疾病患者的免疫評估及診治，也逐漸成為自身免疫病、腫瘤、器官移植、血液系統(tǒng)疾病、重癥監(jiān)護(hù)醫(yī)療、老年醫(yī)學(xué)及保健等學(xué)科的免疫監(jiān)測輔助工具。
國家衛(wèi)健委于今年4月更新的《流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南》在儀器和項目檢測的性能驗證及質(zhì)量控制這塊做了大篇幅的更新，從而讓TBNK的檢測更加規(guī)范。而質(zhì)量控制是結(jié)果準(zhǔn)確發(fā)布的前提，因此做好TBNK的性能驗證及質(zhì)控為臨床結(jié)果的準(zhǔn)確發(fā)布保駕護(hù)航。今天我們一起來看一看指南的介紹。
儀器性能驗證
01 驗證時機(jī)
新儀器啟用前
儀器搬移后
儀器發(fā)生重大維修后（如更換激光、光纖、光電倍增管或流動室等）
儀器軟件系統(tǒng)更新后
儀器性能出現(xiàn)問題或環(huán)境嚴(yán)重失控時
新儀器啟用前儀器搬移后儀器發(fā)生重大維修后（如更換激光、光纖、光電倍增管或流動室等）儀器軟件系統(tǒng)更新后儀器性能出現(xiàn)問題或環(huán)境嚴(yán)重失控時02 驗證項目
靈敏度
散射光靈敏度：采用已知大小的校準(zhǔn)微球檢測儀器的FSC和SSC。在散射光FSC/SSC散點圖上，應(yīng)檢測出直徑0.5mm 或更小的微球，或滿足儀器出廠聲明的要求。
熒光靈敏度：流式細(xì)胞儀能檢測到標(biāo)準(zhǔn)熒光微球上的最少熒光分子數(shù)， 可用MESF表示，常用熒光通道應(yīng)為FITC≤ 200 MESF、PE≤100 MESF 、APC≤200 MESF，或滿足儀器出廠聲明的要求。
靈敏度散射光靈敏度：采用已知大小的校準(zhǔn)微球檢測儀器的FSC和SSC。在散射光FSC/SSC散點圖上，應(yīng)檢測出直徑0.5mm 或更小的微球，或滿足儀器出廠聲明的要求。
熒光靈敏度：流式細(xì)胞儀能檢測到標(biāo)準(zhǔn)熒光微球上的最少熒光分子數(shù)， 可用MESF表示，常用熒光通道應(yīng)為FITC≤ 200 MESF、PE≤100 MESF 、APC≤200 MESF，或滿足儀器出廠聲明的要求。
以8峰微球檢測MESF舉例，每個熒光通道獲取8峰微球的MFI，根據(jù)微球說明書提供的軟件，計算相對應(yīng)熒光通道的MESF。
分辨率散射光分辨率：采用EDTA鹽或肝素抗凝全血，取適量樣品稀釋后直接上機(jī)測定，標(biāo)本在FSC/SSC散點圖可將紅細(xì)胞和血小板清晰地區(qū)分開；取適量樣品裂解紅細(xì)胞后上機(jī)測定，標(biāo)本在FSC/SSC散點圖可將淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞清晰地區(qū)分開，即認(rèn)為散射光分辨率符合要求。
熒光通道分辨率：采用校準(zhǔn)微球上機(jī)測定，各熒光通道的分辨率CV值應(yīng)符合制造商聲明的要求。
熒光通道線性可采用含有不同熒光強(qiáng)度的校準(zhǔn)微球（已知其相應(yīng)熒光素的MESF）進(jìn)行檢測，計算每 一種熒光微球的MFI，以MEFL數(shù)（y）和平均熒光強(qiáng)度（x）的線性回歸，計算相關(guān)系數(shù)（r）。相關(guān)系數(shù)r應(yīng)≥0.98，此方法適用于校準(zhǔn)微球上的熒光素可被定量檢測的熒光通道。
以FITC/PE通道8峰微球舉例
儀器穩(wěn)定性將標(biāo)準(zhǔn)微球充分混勻后上機(jī)進(jìn)行試驗，測試完成后利用直方圖分析實驗結(jié)果，計算標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度FL1，連續(xù)8小時開機(jī)后，再通道條件下重復(fù)檢測，得到標(biāo)準(zhǔn)微球的平均熒光強(qiáng)度FL2，根據(jù)兩次檢測結(jié)果計算偏差，公式見下，每一通道的平均熒光強(qiáng)度變化范圍均應(yīng)在基線值±10%范圍內(nèi)。
攜帶污染率使用濃度為5000個/µL～10000個/µL的校準(zhǔn)微球上機(jī)進(jìn)行測定，獲取至少100000個顆粒，連續(xù)測定3 次，計算檢測通道內(nèi)設(shè)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別記為H1、H2、H3；再使用空白溶液上機(jī)測定，獲取顆粒30s，連續(xù)測試3次，計算該檢測通道內(nèi)設(shè)定區(qū)域的顆粒數(shù)，分別記為L1、L2、L3。按照此步驟重復(fù)循環(huán)3 次。
取上述公式計算最大值。攜帶污染率應(yīng)≤0.5％。
TBNK 性能驗證
01 驗證時機(jī)
項目開展初期
更換試劑品牌后
更換檢測系統(tǒng)后
儀器的重大部件維修后
項目開展初期更換試劑品牌后更換檢測系統(tǒng)后儀器的重大部件維修后02 驗證項目
精密度
批內(nèi)精密度：選取至少5個新鮮全血樣品，樣品的淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞計數(shù)應(yīng)覆蓋低中高水平。每個標(biāo)品從熒光染 色到上機(jī)檢測重復(fù)3次，并確保所有測試都在同一臺儀器的同一批內(nèi)測定，整個操作過程由同一個操作 人員完成。先計算每個樣品重復(fù)3次后檢測結(jié)果的CV,然后計算所有樣品的平均CV，所有樣品的平均CV 宜＜10％，最大不超過20％。實驗室可根據(jù)不同水平的淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞計數(shù)設(shè)定不同程度的可接受CV 標(biāo)準(zhǔn)。
日間精密度：宜使用正常和異常兩個濃度水平的全血質(zhì)控品，每天從熒光染色到上機(jī)測定重復(fù)操作3次， 至少重 復(fù)4天，整個操作過程可由不同操作人員完成。先計算每天每個全血質(zhì)控品重復(fù)3次檢測結(jié)果的CV值，然 后據(jù)此計算每個全血質(zhì)控品4天的平均CV，最后得出兩個全血質(zhì)控品檢測結(jié)果的平均CV。判定標(biāo)準(zhǔn)同上。
精密度批內(nèi)精密度：選取至少5個新鮮全血樣品，樣品的淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞計數(shù)應(yīng)覆蓋低中高水平。每個標(biāo)品從熒光染 色到上機(jī)檢測重復(fù)3次，并確保所有測試都在同一臺儀器的同一批內(nèi)測定，整個操作過程由同一個操作 人員完成。先計算每個樣品重復(fù)3次后檢測結(jié)果的CV,然后計算所有樣品的平均CV，所有樣品的平均CV 宜＜10％，最大不超過20％。實驗室可根據(jù)不同水平的淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞計數(shù)設(shè)定不同程度的可接受CV 標(biāo)準(zhǔn)。
日間精密度：宜使用正常和異常兩個濃度水平的全血質(zhì)控品，每天從熒光染色到上機(jī)測定重復(fù)操作3次， 至少重 復(fù)4天，整個操作過程可由不同操作人員完成。先計算每天每個全血質(zhì)控品重復(fù)3次檢測結(jié)果的CV值，然 后據(jù)此計算每個全血質(zhì)控品4天的平均CV，最后得出兩個全血質(zhì)控品檢測結(jié)果的平均CV。判定標(biāo)準(zhǔn)同上。
穩(wěn)定性樣品穩(wěn)定性：驗證樣品在確定的抗凝及處置條件下的穩(wěn)定性。采集健康人或患者的樣品至少 5 份，即刻染色-裂 解-固定并上機(jī)測定，以此結(jié)果作為基線參考水平，按照實驗室的具體環(huán)境溫度控制條件和預(yù)期的樣品待檢時間，在抗凝劑保存時間內(nèi)，設(shè)置不同的時間點對上述樣品進(jìn)行重復(fù)處理和上機(jī)測定，獲取檢測結(jié)果，并與基線水平結(jié)果進(jìn)行比較，以相對偏差或絕對偏差表示，檢測結(jié)果應(yīng)符合實驗室制定的驗證要求。淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)過低者，宜以絕對偏差進(jìn)行驗證；亦可對試劑說明書聲明的穩(wěn)定性條件進(jìn)行驗證。
處理后標(biāo)本穩(wěn)定性：旨在明確處理后標(biāo)本的最長待檢時間。采集健康人或患者的樣品至少5份，對完成染色-裂解-固定 后的標(biāo)本即刻上機(jī)檢測結(jié)果作為基線水平。按實驗室獲得檢測結(jié)果的最長可接受時間為期限，設(shè)置不同 的時間點對固定后標(biāo)本進(jìn)行上機(jī)檢測。結(jié)果判定同上一條。亦可對試劑說明書聲明的穩(wěn) 定性條件進(jìn)行驗證。
線性范圍適用于淋巴細(xì)胞亞群絕對細(xì)胞計數(shù)。根據(jù)試劑說明書聲明的線性范圍，取一份淋巴細(xì)胞計數(shù)或亞群 計數(shù)接近線性范圍上限的臨床樣品，采用樣品稀釋液按照比例制備 5～9 個不同濃度的標(biāo)本，濃度范圍應(yīng)覆蓋臨床醫(yī)學(xué)決定水平；通過染色-裂解-固定后，上機(jī)測定， 每個標(biāo)本重復(fù)測定 4 次，取均值。分析實際測定的亞群細(xì)胞數(shù)量均值與理論值之間的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù) r 應(yīng)≥0.975。
可比性抗體試劑批次變更前后的可比性驗證：宜使用至少3份健康人的新鮮全血樣品和2份不同濃度質(zhì)控品，采用新批號抗體試劑和當(dāng)前批號抗體 試劑進(jìn)行熒光染色、上機(jī)檢測，以當(dāng)前批號試劑檢測結(jié)果為參考，計算相對偏差或絕對偏差。檢測結(jié)果 應(yīng)符合實驗室制定的驗證要求。驗證要求的制定應(yīng)考慮不同水平的淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)設(shè)定不同程度的偏 差值，淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)過低者，宜以絕對偏差進(jìn)行驗證。
不同檢測系統(tǒng)間的可比性驗證：宜使用至少 5 份新鮮全血樣品（樣品的淋巴細(xì)胞亞群細(xì)胞計數(shù)應(yīng)覆蓋低中高水平）和 2 份不同濃度 水平的全血質(zhì)控品，完成染色-裂解-固定后，分別采用待評價檢測系統(tǒng)和比對檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。比對 檢測系統(tǒng)應(yīng)為儀器性能良好、規(guī)范開展室內(nèi)質(zhì)量控制、室間質(zhì)量評價成績合格的淋巴細(xì)胞亞群常規(guī)檢測 系統(tǒng)，以比對檢測系統(tǒng)的測定結(jié)果為參考，計算相對偏差或絕對偏差。檢測結(jié)果應(yīng)符合實驗室制定的驗 證要求。驗證要求的制定應(yīng)考慮不同水平的淋巴細(xì)胞亞群計數(shù)設(shè)定不同程度的偏差值，淋巴細(xì)胞亞群計 數(shù)過低者，宜以絕對偏差進(jìn)行驗證。
不同檢測人員間的可比性驗證：宜使用至少5份新鮮全血樣品和2份不同濃度水平的全血質(zhì)控品，分別由實驗室內(nèi)淋巴細(xì)胞亞群檢測 培訓(xùn)合格的不同檢測人員完成染色-裂解-固定、上機(jī)檢測和數(shù)據(jù)分析，計算不同檢測人員間檢測結(jié)果的 相對偏差或絕對偏差。驗證結(jié)果應(yīng)符合實驗室制定的驗證要求。
準(zhǔn)確度可使用室間質(zhì)評回報結(jié)果驗證淋巴細(xì)胞亞群項目的準(zhǔn)確度。
TBNK 室內(nèi)質(zhì)控
01 質(zhì)控品選擇
應(yīng)首選商品化全血質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，并至少包括兩個濃度水平，CD4+T細(xì)胞的絕對細(xì)胞計數(shù)應(yīng)包括低值濃度水平質(zhì)控。
應(yīng)首選商品化全血質(zhì)控品進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控，并至少包括兩個濃度水平，CD4+T細(xì)胞的絕對細(xì)胞計數(shù)應(yīng)包括低值濃度水平質(zhì)控。
02 檢測時間
檢測當(dāng)日至少做一次質(zhì)控，質(zhì)控品應(yīng)和患者樣品同時進(jìn)行免疫熒光染色，并在患者標(biāo)本檢測前進(jìn)行上機(jī)測定和數(shù)據(jù)分析。檢測完成后做好相應(yīng)質(zhì)控記錄。
03 靶值建立
實驗室應(yīng)建立每一批次質(zhì)控品的靶值和可接受范圍，不可直接引用說明書提供的質(zhì)控范圍。
更換新批號質(zhì)控品前，可通過每日檢測4次質(zhì)控品（不同時間點），連續(xù)5天收集20次數(shù)據(jù)，計算均值。
檢測當(dāng)日至少做一次質(zhì)控，質(zhì)控品應(yīng)和患者樣品同時進(jìn)行免疫熒光染色，并在患者標(biāo)本檢測前進(jìn)行上機(jī)測定和數(shù)據(jù)分析。檢測完成后做好相應(yīng)質(zhì)控記錄。
03 靶值建立
實驗室應(yīng)建立每一批次質(zhì)控品的靶值和可接受范圍，不可直接引用說明書提供的質(zhì)控范圍。更換新批號質(zhì)控品前，可通過每日檢測4次質(zhì)控品（不同時間點），連續(xù)5天收集20次數(shù)據(jù)，計算均值。均值作為新批次靶值，結(jié)合既往累計CV值推算SD。04 失控判斷標(biāo)準(zhǔn)
應(yīng)至少選擇13S和22S作為失控判斷標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)有相應(yīng)的失控糾正措施。
以CD3+T細(xì)胞質(zhì)控曲線舉例
隨著TBNK項目開展的普及，結(jié)果的準(zhǔn)確與患者免疫狀態(tài)的評估和治療方案的制訂是否能夠正常進(jìn)行的前提與保障。因此TBNK室內(nèi)質(zhì)控尤為重要，可以確保TBNK檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。
如需進(jìn)一步了解性能驗證的內(nèi)容以及質(zhì)控品的介紹，可與貝克曼庫爾特生命科學(xué)的技術(shù)支持和銷售聯(lián)系。● 參考文獻(xiàn)：
1.中華醫(yī)學(xué)會健康管理學(xué)分會,TBNK淋巴細(xì)胞檢測在健康管理中的應(yīng)用專家共識.中華健康管理學(xué)雜志,2023，17(02):85-95
2.WS/T360—2024,流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血淋巴細(xì)胞亞群指南
3.WS/T 406-2012 臨床血液學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求
4. YY/T0588-2017 流式細(xì)胞儀
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