整合單細胞RNA測序和空間轉錄組學描繪癌前病變到侵襲性肺腺癌的演變
期刊：Theranostics
影響因子：12.4
主要技術：snRNA-seq、ST-seq、RNA-seq
導語
本研究運用運用單細胞RNA測序 (scRNA-seq) 和空間轉錄組學(ST)的綜合分析，表征肺腺癌（LUAD）侵襲過程中的動態和連續過程中涉及的細胞生態和空間生態位。研究發現，UBE2C+癌細胞亞群在LUAD侵襲過程中不斷增加，其空間分布在浸潤性腺癌（IAC）的周邊癌區域。此外，對TME細胞類型亞群的分析顯示肥大細胞、單核細胞和淋巴內皮細胞不斷減少，這些細胞參與了侵襲性LUAD的整個過程。同時，從原位腺癌（AIS）到微浸潤腺癌（MIA）的NK細胞和MALT B細胞的增加，從MIA到IAC，Treg 細胞和分泌性B細胞有所增加。值得注意的是，對于AIS，癌細胞、NK 細胞和肥大細胞共定位于癌癥區域，對于IAC，Tregs 與癌細胞共定位。最后發現，癌細胞與TME細胞誘導的TGF-β信號通路的通訊和相互作用參與了IAC的侵襲。研究結果揭示了癌細胞和TME亞群的特定細胞信息和空間結構，以及它們之間的細胞相互作用，這將有助于在LUAD從AIS到IAC的侵襲過程中精準醫學的識別和發展。
研究技術
snRNA-seq、ST-seq、RNA-seq
研究結果
1. LUAD細胞類型鑒定及侵襲過程中的差異表達基因
收集AIS、MIA 、IAC各3個樣本進行scRNA-seq測序（圖1A），經過質控總共獲得了 115,246 個細胞，大致分為C1到C10的10 個細胞譜系，其中6種細胞類型由經典的基因定義，包括上皮細胞、T/NK細胞、B 細胞、骨髓細胞、內皮細胞 、成纖維細胞（圖1B-C）。使用IF來校準細胞的基因標記物的表達(圖1D)。為進一步探討LUAD侵襲過程的機制，研究人員比較了每種細胞類型的基因表達模式，MIA和AIS (M/A)組之間有512個上調和332個下調的DEG，IAC和MIA (I/M)組之間有199個上調和347個下調的 DEG，IAC和AIS (I/A)組之間有393個上調和345個下調DEG。值得注意的是，I/A 組中大約一半上調的DEG在M/A 組中已經可檢測到（圖1E-F）。DEG 的PCA 顯示MIA和IAC在轉錄組水平上非常接近（圖1G），進一步分析揭示了LUAD 三個不同階段的豐富細胞類型（圖1H）。
圖 1
2. 上皮細胞的亞群鑒定及LUAD的起源為確認啟動 LUAD 侵襲的關鍵癌細胞亞簇，將上皮細胞進一步重新聚類為8個亞群，包括Clara-like、TM4SF1+、CRABP2+、UBE2C+4個癌細胞亞群和肺泡I型、肺泡II型、Clara細胞 、纖毛細胞4個正常上皮亞群，以內皮細胞為參考進行CNV分析（圖2A-B）。相對于另外兩個癌細胞亞群，TM4SF1+和UBE2C+的癌細胞亞群比例在LUAD侵襲過程中不斷增加，在IAC中急劇升高，并且從AIS到MIA，UBE2C +亞型的比例變化比TM4SF1+亞型更明顯（圖2C）。IF 和bulk RNA-seq的結果也證實UBE2C +亞型癌細胞從AIS逐漸穩定地增加到IAC（圖2D-E）。研究人員，通過TCGA-LUAD數據庫驗證了UBE2C+癌細胞對LUAD患者預后的影響，發現它可以作為預測LUAD預后的生物標志物（圖2F）。利用ssGSEA分析發現，UBE2C+癌細胞主要富集MYC靶點V1、細胞周期、AKT和TGF-β信號通路等基因集，這些細胞可能通過這些途徑促進癌癥的進展（圖2G）。接下來，運用擬時序分析來破譯LUAD從正常上皮細胞到癌細胞的細胞軌跡，以揭示LUAD的起源，結果表明，UBE2C+癌細胞作為分化最差的癌細胞類型和終末細胞類型（圖2H）。
圖 2
3. UBE2C+細胞亞群參與LUAD 的整個侵襲過程為進一步了解UBE2C+癌細胞，使用bulk RNA-seq數據驗證UBE2C表達水平在LUAD的三個階段逐漸增加（圖3A）。結合TCGA數據集發現UBE2C高表達的患者無進展生存期和總生存期較差（圖3B）。體外實驗證實UBE2C通過影響LUAD增殖和侵襲來介導LUAD的惡性進展（圖3C-D）。此外，體內實驗表明UBE2C沉默顯著減弱了皮下腫瘤的生長（圖3E-G）。這些結果表明UBE2C介導LUAD細胞的增殖和轉移。
圖 3
4. LUAD侵襲中不同TME細胞亞群的研究為了探索不同TME細胞類型在LUAD侵襲過程中的變化，對主要TME細胞群進行了進一步研究。對T/NK細胞重新聚類為8個亞群、骨髓細胞重新聚類為10個亞群（圖4A）。結果發現，TPSB2 +肥大細胞和FCN1 +單核細胞占比從AIS和MIA到IAC逐漸持續下降，GNLY +NK細胞占比僅從AIS到MIA增加，而FOXP3 +Tregs的豐度從MIA到IAC顯著升高（圖4B）。通過bulk RNA-seq和IF進一步證實了細胞亞群變化的情況（圖4C-D）。接下來使用GSVA些細胞亞群變化中涉及的潛在標志信號通路，細胞周期和細胞生長或增殖相關途徑，如PI3K/AKT/MTOR信號等在GNLY+NK和Foxp3+NK中高度富集，WNT和干擾素信號等在TPSB2 +肥大細胞和FCN1+單核細胞富集（圖4E-F）。因此，研究人員提出Tregs 增加和單核細胞減少介導的腫瘤相關通路的激活可促進早期LUAD侵襲。
圖 4
5. TGF-β信號通路在晚期LUAD的侵襲中發揮關鍵作用CellChat分析結果揭示了LUAD中細胞之間的前十個相互作用途徑（圖5A）。在AIS和MIA中沒有觀察到癌細胞和TME細胞之間通過TGF-β信號傳導進行的通訊，但這種相互作用在IAC中顯著加強，特別是在NK、肥大和MALT B細胞中，與之前的結果一致（圖5B)。進一步的分析發現，與AIS和MIA相比，癌細胞和TME細胞中TGF-β配體的水平在IAC中廣泛上調（圖5C）。同樣的，下游靶基因以及TGF-β途徑的下游因子p-SMAD2的表達水平在IAC中高度激活（圖5D-E）。這些結果意味著癌細胞和TME細胞之間TGF-β信號傳導的通訊和相互作用在IAC中誘導的TGF-β信號傳導的無限制激活可能在晚期LUAD的侵襲中發揮關鍵作用。
圖 5
6. 癌癥區域Tregs的空間分布介導LUAD侵襲通過scRNA-seq分析的AIS、MIA、IAC各2個樣本進一步進行 ST。基于HE染色，將樣本分為四個不同的組織學區域，包括癌區域、正常上皮區域、基質區域和淋巴區域（圖6A）。AIS樣本TD8通過ST分為四個區域（圖6B），通過marker基因的表達進一步證實了空間劃分的準確性（圖6C）。如預期，TM4SF1+癌細胞、GNLY+NK細胞、NKG7+NK和TPSB2+肥大細胞在癌癥中共定位，但未發現FOXP3+ Tregs（圖6D）。同樣研究了兩例IAC 對應的空間和細胞數據，ST也清晰的區分四個區域，與HE染色結果高度一致（圖6A-B）。TM4SF1 + 癌細胞和 UBE2C+癌細胞在癌癥區域富集，CAF（Fib-1）和 FOXP3+Tregs與癌細胞亞群共定位（圖6D）。與AIS相比，IAC的癌癥脈管系統區域呈現出更明顯的血管數量和更高表達水平的VEGFs與正常的區域相比，相反，AIS沒有明顯的差異（圖6E-G）。這一發現表明血管生成可能對 LUAD 的侵襲過程有顯著貢獻。
圖 6
7. 邊緣癌區域比ST分析的中心癌區域更活躍為了進一步了解scRNA-seq確定的四個癌癥亞群的空間分布和生物學意義，研究人員將癌癥區域重新聚集為亞區。AIS的TD8樣本，由中央區(黑色)和外圍區域(紅色)組成(圖7A)。結果發現，Clar-like癌細胞在外圍區域高度富集，中央區域以TM4SF1+癌細胞為主(圖7B)。Wnt/β-Catenin、血管生成通路等致癌信號在外圍區域高度(圖7D)。值得注意的是，與TGF-β信號通路相關的基因在中心區域高表達(圖7E），增殖指數在外圍區域高表達(圖7F)。在MIA中，區域的富集與AIS類似。但是富集途徑不同，EMT通路在外周區域2高度激活，而在中央區域0處于惰性狀態(圖7D)。最后，分析IAC樣本，中心區域和外圍區域都高度富集TM4SF1+癌細胞和UBE2C+癌細胞，特別是區域5，TGF-β信號通路相關的基因在癌區5高表達（圖7C-E）。總之，這些發現表明UBE2C+癌細胞亞群在驅動AIS 到 MIA過程中起著至關重要的作用，癌細胞與TME之間的TGF-β信號相互作用以及調節免疫逃逸的空間變化與LUAD侵襲有關（圖 7G）。
圖 7
參考文獻：
Zhu J, Fan Y, Xiong Y, et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Exp Mol Med. 2022 Nov;54(11):2060-2076. doi: 10.1038/s12276-022-00896-9. Epub 2022 Nov 25. PMID: 36434043; PMCID: PMC9722784.
Copyright(C) 1998-2025 生物器材網 電話：021-64166852;13621656896 E-mail：info@bio-equip.com