AlphaLISA®因其靈敏度、多功能性和與自動化的內在兼容性而被廣泛用于支持高通量篩選活動。該技術遵循均質、免洗的實驗方案，當專門的供體珠和受體珠通過結合反應接近時，會產生可測量的光信號。通過使用AlphaLISA®來篩選化學文庫中破壞結合的能力，研究人員可以為苗頭到先導(Hit-to-Lead)進展快速識別化合物。
 
盡管AlphaLISA®提供了許多好處，但該技術仍存在一些限制。首先，珠子有沉降的傾向，需要使用儀器來保持其均勻的懸浮液。AlphaLISA® 試劑也相對昂貴，這意味著必須盡量減少死體積以減少浪費和降低成本。此外,供體微珠對光敏感，要求試劑遠離陽光直射且實驗室照明變暗。
 
使用來自 Formulatrix 的 TEMPEST® 液體處理器，并與 HighRes Biosolutions® 合作將儀器與現有的自動化平臺集成，圣裘德兒童研究醫院的研究人員能夠在AlphaLISA®檢測中快速篩選重點化合物庫，篩選出早期癌癥候選藥物。該項目的成功得益于TEMPEST®的許多關鍵功能，即內建的AlphaLISA®珠子再循環能力、從單個分液器分配多種試劑的能力以及極低的死體積。
 
   
AlphaLISA®是一種基于微珠相互接近的檢測方法
 
盡管AlphaLISA®可以根據所研究的分析物采用各種配置，但分析原理始終涉及兩個珠子相互作用以產生可測量的光信號。在此處描述的研究中，圣裘德兒童研究醫院的研究人員利用AlphaLISA®技術篩選了一個包含大約 4,900 種化合物的庫，目的是識別能夠阻斷專有目標蛋白與底物之間相互作用的單個分子。
 
在AlphaLISA®反應過程中，使用鏈霉親和素包被的供體珠結合生物素化底物，使用抗His 包被的受體珠結合His標簽的靶蛋白。然后用 680nm 的光激發供體珠子，使它們釋放單線態氧分子。由于靶-底物結合，供體珠和受體珠非常接近，單線態氧分子與受體珠的反應導致波長為 610nm 的光發射。
 
相反，當目標-底物相互作用被化合物阻斷時，珠子相距太遠，單線態氧轉移無法有效進行，且無法檢測到610nm的光信號（見圖2）。
   
TEMPEST® 再循環功能可防止由于AlphaLISA®珠子沉降引起的測定漂移
 
AlphaLISA®珠子因其沉降傾向而為人所知，這種特性會導致隨時間而顯著的實驗漂移和信號完全丟失。解決此問題的一種方法是在AlphaLISA®測定期間用磁力攪拌器不斷混合供體和受體珠溶液，但這種方法并不總是能保證有效混合（例如，在磁棒未對準的情況下）；如果裝有珠子的容器意外翻倒，這也可能導致有價值的試劑丟失。
 
TEMPEST®可以選擇以預設間隔重新充注儀器芯片，再循環AlphaLISA®珠試劑，以在整個檢測過程中保持均勻的懸浮液。充注芯片會將珠子返回到試劑容器中，不僅在容器內混合溶液，而且還確保芯片中的試劑保持活性（見圖3）。通過將再循環間隔設置為1分鐘，圣裘德兒童研究醫院的研究人員消除了微珠沉降問題，而不會因操作錯誤而導致試劑損失的風險。
   
TEMPEST® 低死體積最大限度地減少試劑浪費
 
任何涉及自動試劑分配的分析都必須在使用前考慮與儀器充注相關的死體積。由于AlphaLISA® 試劑相當昂貴，因此將死體積保持在最低限度通常是首要考慮的問題，尤其是對于那些進行高通量篩選實驗的人。通過使用TEMPEST® 將AlphaLISA®珠添加到測定板，研究人員可以憑借非常低的充注體積來降低成本。

圣裘德兒童研究醫院的研究人員估計，他們將需要大約65-66毫升的每種微珠試劑來運行初始AlphaLISA®篩選，同時使用TEMPEST®液體處理器進行微珠添加。在確定70毫升的制劑足以測試所有4,900種化合物而不會耗盡試劑后，他們指出，這一體積將產生大約12%的總廢物。相比之下，使用現有的分配器，計算出的浪費接近30%，因為需要為每個篩分板充注和排空管道，以保持均勻的溶液。浪費的微珠從30%減少到12%，這轉化為可觀的成本節約，突出了TEMPEST®在提高分析效率方面的效用（見圖 4）。
   
靈活性的增強改進了現有的AlphaLISA®工作流程
 
許多自動化的高通量檢測由于試劑輸入能力低而導致時間線延長。例如，使用單一的傳統分液器分配AlphaLISA®測定的每個單獨成分，需要在實驗期間多次清洗管道，增加了大量的延遲和手動步驟，無法實現自動化。盡管通過在同一檢測中組合多個分液器可以縮短時間，并使檢測完全自動化，但空間的可用性往往使其不切實際。
 
TEMPEST®液體處理儀能夠從一個芯片中分配多達12種試劑，大大增強了測定的靈活性。能夠用一臺儀器將兩種微珠試劑溶液分配到同一個檢測板上，使圣裘德兒童研究醫院的研究人員能夠簡化AlphaLISA®工作流程，并設計出以前只限于單一試劑輸入的檢測方法（見圖5）。
   
高質量的AlphaLISA®篩選性能轉化為強大的苗頭化合物鑒定
 
在使用TEMPEST®對所有AlphaLISA®微珠添加的4900個化合物庫進行篩選后，圣裘德兒童研究醫院的研究人員以多種方式評估了篩選數據的質量。使用z'因子作為測定窗口和每個控制孔內的變異性的綜合衡量標準，他們發現AlphaLISA®測定可靠地產生z'因子，高于設定的截止值（0.5），并且在整個篩選過程中表現出板與板之間的一致性，沒有隨著時間的推移出現重大變化（見圖6）。
 
支持這一發現的還有，很明顯，陽性和陰性對照之間沒有重疊，而且各孔板的對照值變化很小。這使我們有信心識別出18種化學化合物，并逐步進行劑量反應測試，其中2 1種化合物（IC50 < 1µM)目前正在進行進一步研究。
圣裘德兒童研究醫院的研究人員證明了TEMPEST®是AlphaLISA®的一項強大技術，展示了它與其他基于磁珠的高通量篩選的潛力。TEMPEST的很多附加產品特性增強了其再循環功能、低死體積和儀器的靈活性，而所有這些特性都支持現有技術的改進，增加了新興測定技術的范圍。