細胞復蘇實驗的詳細過程說明
細胞復蘇是通過快速融化的手段保證細胞外結(jié)冰晶在很短時間內(nèi)融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞重新結(jié)晶對細胞造成損害，復蘇成功的細胞可以保持很高的活力。細胞復蘇的過程需要嚴格的溫度控制，以確保細胞的活力和完整性。一旦溫度過高或過低，都可能對細胞造成不可逆的損傷，影響實驗的順利進行。在操作過程中，科學家們必須全神貫注，如同呵護脆弱的生命之花。
細胞復蘇的原則：快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。
實驗前準備：
1.將水浴鍋提前預熱至37℃。
2.細胞實驗室進行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。
一、取出凍存管
1.根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。
2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。
二、迅速解凍
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷地搖動，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。
三、平衡離心
用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3分鐘。
四、制備細胞懸液
1.吸棄上清液。
2.向離心管內(nèi)加入適量完全培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。
3.用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
五、細胞計數(shù)
細胞濃度以5×105/mL為宜。
六、培養(yǎng)細胞
將符合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h（或者24-48h）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間根據(jù)細胞情況而定。
七、記錄復蘇日期
八、結(jié)果分析：
判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細胞，臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數(shù)板和計數(shù)器計數(shù)細胞，得出細胞存活率）。
如果復蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數(shù)量。
注意事項：
1. 實驗前做好準備工作，如預熱水浴鍋、配制并預熱培養(yǎng)基、實驗器材的準備。確保避免因?qū)嶒灉蕚洳怀浞謱е录毎麖吞K失敗。
2. 取細胞時應做好防護措施，帶好防凍手套，護目鏡。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
3. 若液氮罐距離水浴鍋距離較遠，需要對凍存管進行保冷后轉(zhuǎn)移到水浴鍋旁，避免路途中導致細胞融化。可用-80℃預冷的程序降溫盒轉(zhuǎn)移細胞，但不可長時間滯留，應盡快化凍復蘇。
4. 細胞放入水浴中注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，并防止水浴時水進入細胞凍存管污染細胞。打開細胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞?br />
5. 若細胞較珍貴，在吸取細胞時要保留槍頭或移液管，用培養(yǎng)基沖洗上面殘留的細胞。
6. 快速操作的目的：一是防止長時間常溫下DMSO對細胞產(chǎn)生毒性；二是在低溫到常溫的過程中，水分會重新進入細胞并形成冰晶，快速升溫可以使冰晶迅速融化，避免傷害細胞。
7. 離心的主要目的是通過換液取出含有DMSO的凍存液，若細胞對DMSO耐受，可不離心。
細胞復蘇的原則：快速融化
必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃，使細胞外凍存時的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結(jié)晶，對細胞造成損害。
實驗前準備：
1.將水浴鍋提前預熱至37℃。
2.細胞實驗室進行常規(guī)消毒，用75％酒精擦拭紫外線照射40min的超凈工作臺臺面，保證無菌。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等即將使用的耗材及試劑。
一、取出凍存管
1.根據(jù)細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的對應編號。
2.從液氮罐中取出細胞盒，取出所需的細胞，同時核對管外的編號。
二、迅速解凍
1.迅速將凍存管投入到已經(jīng)預熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷地搖動，使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺內(nèi)。
三、平衡離心
用架盤天平平衡后，放入離心機中3000r/min 離心3分鐘。
四、制備細胞懸液
1.吸棄上清液。
2.向離心管內(nèi)加入適量完全培養(yǎng)液，吹打制成細胞懸液。
3.用培養(yǎng)液懸液混懸沉淀細胞，細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
五、細胞計數(shù)
細胞濃度以5×105/mL為宜。
六、培養(yǎng)細胞
將符合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內(nèi)，將培養(yǎng)瓶放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)2-4h（或者24-48h）后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng)，換液的時間根據(jù)細胞情況而定。
七、記錄復蘇日期
八、結(jié)果分析：
判斷細胞復蘇成功與否，需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率（細胞存活率將凍存管內(nèi)剩余的細胞，臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞，活細胞不著色。用細胞計數(shù)板和計數(shù)器計數(shù)細胞，得出細胞存活率）。
如果復蘇后95%以上的細胞貼壁，而且細胞的活性好，這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長，達到正常的生長特性（比如細胞群體倍增時間等）后要再凍存以補充細胞儲存數(shù)量。
注意事項：
1. 實驗前做好準備工作，如預熱水浴鍋、配制并預熱培養(yǎng)基、實驗器材的準備。確保避免因?qū)嶒灉蕚洳怀浞謱е录毎麖吞K失敗。
2. 取細胞時應做好防護措施，帶好防凍手套，護目鏡。細胞凍存管可能漏入液氮，解凍時凍存管中的氣溫急劇上升，可導致爆炸。
3. 若液氮罐距離水浴鍋距離較遠，需要對凍存管進行保冷后轉(zhuǎn)移到水浴鍋旁，避免路途中導致細胞融化。可用-80℃預冷的程序降溫盒轉(zhuǎn)移細胞，但不可長時間滯留，應盡快化凍復蘇。
4. 細胞放入水浴中注意用鑷子夾住細胞凍存管并在水浴中不時晃動，使其受熱均勻，并防止水浴時水進入細胞凍存管污染細胞。打開細胞凍存管之前要用酒精棉球?qū)龃婀芟静⒘栏伞?br />
5. 若細胞較珍貴，在吸取細胞時要保留槍頭或移液管，用培養(yǎng)基沖洗上面殘留的細胞。
6. 快速操作的目的：一是防止長時間常溫下DMSO對細胞產(chǎn)生毒性；二是在低溫到常溫的過程中，水分會重新進入細胞并形成冰晶，快速升溫可以使冰晶迅速融化，避免傷害細胞。
7. 離心的主要目的是通過換液取出含有DMSO的凍存液，若細胞對DMSO耐受，可不離心。
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