當培養細胞增殖達到一定密度（70%-80%）后，將會出現密度抑制現象，表現為細胞的生長和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。貼壁細胞會在培養瓶中長成致密單層（懸浮細胞會充滿整個體積的培養液），并鋪滿培養瓶底部，如果不及時進行分瓶處理，細胞將會逐漸走向衰老、死亡。

而將培養的細胞從一個容器以適當比率轉移到其他容器中進行擴大培養，稱為細胞傳代。

一：細胞傳代目的

1、 完成細胞數量的擴增。

2、 避免因細胞進入平臺期或衰亡期，而發生大量死亡。

二：細胞傳代步驟參考（以T25瓶為例）

 

貼 壁 細 胞

1、吸去培養液：取對數生長期的貼壁細胞（細胞融合度70%-80%）。吸去培養上清液，用不含鈣、鎂離子的PBS 2 mL潤洗細胞1-2次。

細胞融合度判斷參考圖
 

2、加消化液：加1 mL胰酶消化液于培養瓶中，蓋好瓶蓋，使胰酶消化液均勻地浸潤細胞表面，置于37℃培養箱中消化1-2分鐘。

3、消化觀察：期間可在顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞大部分變圓并脫落，準備終止消化。

4、加培養基終止消化：加入3-4 mL完全培養基終止消化，緩慢吹打細胞懸液，轉移到離心管中。

5、離心：將細胞懸液放入離心機配平，進行離心（800-1000 rpm，3-5 min）。

6、棄上清：去掉細胞上清液。

7、重懸細胞：用新鮮的培養基重懸細胞，接種到新的培養器皿中。

8、分裝：根據細胞生長特性和后續的實驗要求，進行分裝傳代的操作。

 

懸 浮 細 胞

1、收集：輕輕吹散懸浮細胞，部分貼壁松散的懸浮細胞可直接吹打培養瓶底部使細胞懸浮，收集細胞懸液到無菌離心管中。

2、離心棄上清：按離心800-1000 rpm，3-5 min，進行操作，離心完吸出上清摒棄。

3、接種傳代：加入適量新鮮培養基重懸細胞，按比例接種至培養瓶（接種比例按實際情況，不確定可計數后再接種），常規細胞推薦以3-5*10^5 cells/mL傳代。

 

半 貼 半 懸  細 胞

1、收集懸浮細胞：用移液器吸出培養液轉移到無菌離心管中（懸浮細胞部分）。

2、收集貼壁細胞：用1 mL PBS清洗細胞，吸出后放入上述離心管中（貼壁細胞部分）。

3、加消化液：培養瓶中加入1 mL 胰酶消化液，放入培養箱中靜置消化。

4、消化觀察：消化的時間依據細胞本身特性，可邊消化邊觀察，細胞大部分脫落或變圓，即可終止消化，全程不要拍打培養瓶。

5、接種傳代：按照適當的比例接種新的培養瓶進行傳代培養。

三：細胞傳代注意事項

 

1、牢記無菌意識；

2、把握傳代時機，對數增長期或細胞融合度達到70%-80%進行傳代；

3、均勻消化，減少細胞團塊的形成；

4、吹打過程動作的輕柔，避免產生氣泡；

5、適度消化；

6、傳代比例合適，避免細胞傳代頻繁或代次紊亂；

7、使用一次性移液管，避免交叉污染。

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