斑馬魚與小鼠一樣，是一種著名的動(dòng)物模型，廣泛應(yīng)用于表觀遺傳學(xué)、毒理學(xué)、臨床研究、神經(jīng)科學(xué)等生物學(xué)研究。這主要是因?yàn)榘唏R魚的胚胎和幼體易于遺傳操作，而且它們體積小，光學(xué)清晰度高，易于用光學(xué)顯微鏡觀察。

圖1 利用斑馬魚在藥物篩選中觀察生物體表型^[1]

圖2 藥物篩選、自動(dòng)成像以及斑馬魚幼體分析^[2] 

    Celloger^® Mini Plus提供了一個(gè)自動(dòng)生成多層圖像的Z-stacking功能，Celloger^®分析軟件提供了一個(gè)合并功能，可以輕松地組合多層熒光圖像。這些功能使研究人員能夠在單個(gè)圖像中觀察三維(3D)結(jié)構(gòu)。通過功能表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚(幼魚)，詳見下面的步驟1和2。

圖3 Celloger^® Mini Plus設(shè)備圖
 

應(yīng)用實(shí)例：

步驟1，Z-stacking

    如由細(xì)胞組成的組織，根據(jù)焦點(diǎn)可以提供各種信息，因此確定各種焦點(diǎn)是至關(guān)重要的。通過設(shè)置層與層之間的距離(“Step”)和拍攝的圖像數(shù)量(“N,N”)，使用Celloger®MiniPlus可以在設(shè)置位置(Z位置)的上方和下方以固定的間隔(“Step”)生成多層圖像(圖4)。每個(gè)觀察點(diǎn)可以輸入不同的設(shè)置，并且可以在不同的觀察點(diǎn)執(zhí)行不同的Z-stacking設(shè)置。

圖4 Z-stacking

    我們使用Celloger^® MiniPlus來創(chuàng)建轉(zhuǎn)基因斑馬魚的Z-stacking圖像。由于3D幼魚的每個(gè)部分可接受的焦平面不同，我們通過操縱自動(dòng)移動(dòng)的Z軸來驗(yàn)證合適的焦平面。我們在多個(gè)焦平面中識別出了上焦平面(Z=4.585)和下焦平面(Z=4.685)，并將中間對應(yīng)的坐標(biāo)(Z=4.635)設(shè)置為掃描位置；并且以掃描位置為中心，在位置的上方和下方各設(shè)置以10µm間隔拍攝5張照片(圖5)。

圖5 斑馬魚幼魚拍攝過程

    圖6顯示了斑馬魚的上、中、下焦平面拍攝的照片。側(cè)視圖下焦平面頭部形狀清晰，上焦平面腹側(cè)部清晰可見。

圖6 斑馬魚拍攝結(jié)果

步驟2，Z-projection

    多層成像(Z-stacking)是觀測三維模型的必要手段。然而，解釋多層成像獲得的多幅圖像的結(jié)果是費(fèi)力和耗時(shí)的。Z-projection函數(shù)將多個(gè)圖層合并為一幅圖像，使一個(gè)3D樣本可以作為一幅圖像被清晰完整地觀察到，增加了研究人員的洞察力。

    Z-projection類型是對位于每個(gè)X-Y位置的多個(gè)Z坐標(biāo)進(jìn)行積分的方法。“Maximum”用于整合幾個(gè)Z坐標(biāo)點(diǎn)中最亮的像素，而“Average”用于計(jì)算幾個(gè)Z坐標(biāo)點(diǎn)的平均亮度(圖7)。此外，在Celloger^®分析軟件中添加了可以增強(qiáng)的元素“add deviation value”，以獲得更清晰的圖像。

圖7 Z-projection類型 

    在Celloger^®分析軟件中打開Z-stacking拍攝的圖像，點(diǎn)擊Z-stack選項(xiàng)卡上的“merge”按鈕，可以得到Z-projection圖像(圖8)。不同的樣本對應(yīng)的Z-projection類型不同，建議對每種類型進(jìn)行確認(rèn)。

圖8 Z-projection過程 

    圖9顯示了通過選擇“maximum”類型和“add deviation value”選項(xiàng)拼接三幅圖像進(jìn)行投影的結(jié)果。在底部焦平面上清晰地表達(dá)了頭部結(jié)構(gòu)，在頂部焦平面上可以觀察到的獨(dú)特的腹側(cè)形狀，使用投影函數(shù)將其表達(dá)為單個(gè)圖像。

圖9 結(jié)果圖

    我們使用Celloger^® Mini Plus系統(tǒng)成功獲得了斑馬魚的高質(zhì)量熒光圖像。將三維結(jié)構(gòu)的多層信息成功地組合并清晰地表達(dá)在一張圖像中。該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了使用各種其他樣品類型捕獲3D圖像的可行性，包括球體和類器官，這可以擴(kuò)大研究人員可用的研究范圍。
 

結(jié)語：

    斑馬魚作為一種廣泛使用的動(dòng)物模型，用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、藥物篩選和表觀遺傳學(xué)等研究模型，具有完全表征的基因組，并且與人類表現(xiàn)出高度的遺傳同源性。作為一種易于遺傳改造及使用的模型，大量的細(xì)胞熒光報(bào)告基因和尖端成像技術(shù)更加推進(jìn)了斑馬魚在模型方面的潛力。Celloger^®活細(xì)胞成像設(shè)備無需反復(fù)拿取細(xì)胞樣本，在培養(yǎng)箱內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞的可視化以及進(jìn)行長期動(dòng)力學(xué)測定。利用延時(shí)成像技術(shù)及Z-stacking功能，獲得更清晰的3D熒光成像效果。隨著系統(tǒng)研究的推進(jìn)和斑馬魚成像效果的提升，這種模式生物可能會繼續(xù)在多種研究領(lǐng)域發(fā)揮關(guān)鍵作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] Rosa JGS, Lima C, Lopes-Ferreira M. Zebrafish Larvae Behavior Models as a Tool for Drug Screenings and Pre-Clinical Trials: A Review. Int J Mol Sci. 2022 Jun 14;23(12):6647. 

[2] Chia K, Klingseisen A, Sieger D, Priller J. Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease. Front Mol Neurosci. 2022 Oct 13;15:940484.