熒光定量PCR中反應中的Ct值全面分析
熒光定量PCR（qPCR）是目前病原檢測領域使用最為廣泛的核酸檢測方法（PCR檢測技術概述）。尤其是非洲豬瘟發生后，qPCR檢測得到了極大的普及，對于剛剛進入qPCR檢測領域的人，很容易鉆入了“唯Ct值"的牛角尖，下面來詳細介紹qPCR中的Ct值。
1、Ct值的基本概念
閾值循環數 Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值，熒光信號大于熒光閾值時PCR循環數。儀器軟件通常將第3-15個循環的熒光值設為基線（baseline），是由于測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調節。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號，用于定義Ct值。Ct會受到閾值的影響，每次試驗由于樣品和儀器的不同會導致基線不同，進而影響閾值和Ct值。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在一定線性關系,起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。
2、Ct值的范圍
Ct值的范圍為15-35。Ct值小于15，認為擴增在基線期范圍內，未達到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數的對數存在線性關系，也就是標準曲線。通過標準曲線，擴增效率為100%時，計算出基因單個拷貝數定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數小于1，可認為無意義。
3、Ct值的影響因素
由擴增循環數和產物量之間的關系：擴增產物量=起始模板量×（1+En）循環個數，可以看出，在理想條件下，起始模板量和En會對Ct值產生影響。模板質量或者擴增效率的差異會造成Ct值偏大或過小。
擴增效率Efficiency (En):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在一定線性關系,起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。
4、與Ct值有關的參數
標準曲線Standard curve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。
相關系數Correlation coefficient (R^2) ：反映了標準曲線的線性，通常要求>0.99。
擴增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
斜率Slope ：當擴增效率為100%時斜率為-3.32，當90%-110%時的斜率為-3.58 ~ -3.10。
5、Ct值與模板拷貝數的關系
理想情況下，qPCR的模板經過一定的循環數進行指數擴增，擴增循環數和產物量之間的關系是：擴增產物量Cn=起始模板量C1×（1+擴增效率E）^循環數n。但是由于E通常無法達到100%，并且在擴增的后期，擴增效率會逐漸降低，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始濃度差2倍。
由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。這是目前的qPCR定量的方法，即用已知濃度的標準品與未知濃度樣品同時擴增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標準曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量結果的不準確。標準曲線需滿足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同時定量標準品的量值需要準確可靠。
用qPCR進行定量，理論上可行，實際上很難獲得準確的定量結果。
6、qPCR中Ct值的幾點思考
①、Ct值能否直接換算成模板拷貝數？
通過制作標準曲線（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10）的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數，前提是需要樣品與標準品同時擴增，定量標準品需要使用標準物質等定量準確的物質（OD260/280換算的的拷貝數誤差很大），即使如此定值結果仍存在一定的誤差。
②、熒光定量PCR是否為定量方法？
雖然名字里有“定量”，但是qPCR的間接定量方式又復雜，又受很多因素影響，并不絕對準確，在計量領域是不被認可的。目前的核酸檢測方法中只有數字PCR是真正的定量檢測方法，其余的都是定性檢測方法。
③、Ct值能否作為評價qPCR試劑盒的指標？
qPCR試劑的評價需要從分析敏感性（最低檢測限），分析特異性（交叉反應），重復性（精密度），診斷敏感性，診斷特異性等多個指標去衡量。僅憑Ct值的高低去判斷一個qPCR試劑盒的優劣并不夠科學，不同試劑盒的Ct值不具有可比性。有些試劑盒采取先進行幾個循環的預擴增，再進行正式循環的做法就是為了使Ct值看起來更低。
④、能否通過增加擴增循環數來增加試劑盒的敏感性？
不能！
理論上，假設初始模板量為1個拷貝，酶的擴增效率100%，到達最大閾值約需要35個循環，因此業內通常認為qPCR的有效線性范圍為Ct:15-35。通常酶的擴增效率無法達到100%，達到1個拷貝模板的循環數可能會達到38或更高。當酶的效率更低或者存在抑制劑時，檢測到1拷貝模板的循環數的Ct值可能會更高。
初始模板核酸濃度≤1 copies/μL時，這時的影響因素不光是你能否檢測到，還取決于你每次能取到模板的概率。因為在低濃度下，每次取到模板的概率是服從泊松分布的。
7、溫馨提示：
①、每個qPCR試劑盒在上市前通常會按照行業統一的標準進行各種指標的系統評估，試劑盒生產企業通常會提供這些參數供客戶進行選擇和驗證。檢測實驗室均具備對試劑盒進行性能驗證的能力。
②、一個qPCR試劑盒的核心是引物探針設計、酶、反應體系和最優的反應條件，qPCR產品的銷售推廣工作，對營銷服務人員要求技術較高，方可規避誤導推廣。
③、對于檢測來說，qPCR試劑盒只是其中的一個環節。如果想得到可靠的檢測結果，還需要對采樣、運輸、保存、處理、提取和擴增的每個環節，進行質量控制（檢測全流程質量控制）。實驗室檢測人員也不能持有，解決了qPCR試劑盒的問題就解決了檢測中所有問題的非理性觀點。
1、Ct值的基本概念
閾值循環數 Threshold cycle (Ct) 也寫作Cq值，熒光信號大于熒光閾值時PCR循環數。儀器軟件通常將第3-15個循環的熒光值設為基線（baseline），是由于測量的偶然誤差引起的。閾值（threshold）一般是基線的標準偏差的10倍。在實際操作中也可以手動調節。高于閾值的熒光信號被認為是真實的信號，用于定義Ct值。Ct會受到閾值的影響，每次試驗由于樣品和儀器的不同會導致基線不同，進而影響閾值和Ct值。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在一定線性關系,起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。
2、Ct值的范圍
Ct值的范圍為15-35。Ct值小于15，認為擴增在基線期范圍內，未達到熒光閾值。理想情況下，Ct值與模板起始拷貝數的對數存在線性關系，也就是標準曲線。通過標準曲線，擴增效率為100%時，計算出基因單個拷貝數定量的Ct值在35左右，若大于35，理論上模板起始拷貝數小于1，可認為無意義。
3、Ct值的影響因素
由擴增循環數和產物量之間的關系：擴增產物量=起始模板量×（1+En）循環個數，可以看出，在理想條件下，起始模板量和En會對Ct值產生影響。模板質量或者擴增效率的差異會造成Ct值偏大或過小。
擴增效率Efficiency (En):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在一定線性關系,起始模板量濃度越高，Ct值越小；起始模板量濃度越低，Ct值越大。PCR循環在到達Ct值所在的循環數時，剛剛進入真正的指數擴增期（對數期），此時微小誤差尚未放大，Ct值的重現性較好，即相同含量的初始模板，得到的Ct值是相對穩定的。
Ct值不是恒定不變的，可以受到不同樣品、不同儀器的影響，即使相同的樣品在相同的儀器上重復2遍，Ct值也會存在差異。
4、與Ct值有關的參數
標準曲線Standard curve：模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表起始拷貝數的對數，縱坐標代Ct值。
相關系數Correlation coefficient (R^2) ：反映了標準曲線的線性，通常要求>0.99。
擴增效率Efficiency (E):通常要求在90%~110%。效率低于100%，是由于PCR反應中存在抑制因素；而高于100%可能一些污染、非特異性擴增或者是引物二聚體造成。
斜率Slope ：當擴增效率為100%時斜率為-3.32，當90%-110%時的斜率為-3.58 ~ -3.10。
5、Ct值與模板拷貝數的關系
理想情況下，qPCR的模板經過一定的循環數進行指數擴增，擴增循環數和產物量之間的關系是：擴增產物量Cn=起始模板量C1×（1+擴增效率E）^循環數n。但是由于E通常無法達到100%，并且在擴增的后期，擴增效率會逐漸降低，只有在理想的情況下才滿足Cn=C1×2^n，即Ct值差1，初始濃度差2倍。
由于Ct值與起始模板的對數存在線性關系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定。這是目前的qPCR定量的方法，即用已知濃度的標準品與未知濃度樣品同時擴增，將未知濃度樣品的Ct值代入該標準曲線獲得未知樣品濃度。分析定量時，一般取Ct:15-35。太大或者太小都會導致定量結果的不準確。標準曲線需滿足：E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10。同時定量標準品的量值需要準確可靠。
用qPCR進行定量，理論上可行，實際上很難獲得準確的定量結果。
6、qPCR中Ct值的幾點思考
①、Ct值能否直接換算成模板拷貝數？
通過制作標準曲線（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58 ~ -3.10）的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數，前提是需要樣品與標準品同時擴增，定量標準品需要使用標準物質等定量準確的物質（OD260/280換算的的拷貝數誤差很大），即使如此定值結果仍存在一定的誤差。
②、熒光定量PCR是否為定量方法？
雖然名字里有“定量”，但是qPCR的間接定量方式又復雜，又受很多因素影響，并不絕對準確，在計量領域是不被認可的。目前的核酸檢測方法中只有數字PCR是真正的定量檢測方法，其余的都是定性檢測方法。
③、Ct值能否作為評價qPCR試劑盒的指標？
qPCR試劑的評價需要從分析敏感性（最低檢測限），分析特異性（交叉反應），重復性（精密度），診斷敏感性，診斷特異性等多個指標去衡量。僅憑Ct值的高低去判斷一個qPCR試劑盒的優劣并不夠科學，不同試劑盒的Ct值不具有可比性。有些試劑盒采取先進行幾個循環的預擴增，再進行正式循環的做法就是為了使Ct值看起來更低。
④、能否通過增加擴增循環數來增加試劑盒的敏感性？
不能！
理論上，假設初始模板量為1個拷貝，酶的擴增效率100%，到達最大閾值約需要35個循環，因此業內通常認為qPCR的有效線性范圍為Ct:15-35。通常酶的擴增效率無法達到100%，達到1個拷貝模板的循環數可能會達到38或更高。當酶的效率更低或者存在抑制劑時，檢測到1拷貝模板的循環數的Ct值可能會更高。
初始模板核酸濃度≤1 copies/μL時，這時的影響因素不光是你能否檢測到，還取決于你每次能取到模板的概率。因為在低濃度下，每次取到模板的概率是服從泊松分布的。
7、溫馨提示：
①、每個qPCR試劑盒在上市前通常會按照行業統一的標準進行各種指標的系統評估，試劑盒生產企業通常會提供這些參數供客戶進行選擇和驗證。檢測實驗室均具備對試劑盒進行性能驗證的能力。
②、一個qPCR試劑盒的核心是引物探針設計、酶、反應體系和最優的反應條件，qPCR產品的銷售推廣工作，對營銷服務人員要求技術較高，方可規避誤導推廣。
③、對于檢測來說，qPCR試劑盒只是其中的一個環節。如果想得到可靠的檢測結果，還需要對采樣、運輸、保存、處理、提取和擴增的每個環節，進行質量控制（檢測全流程質量控制）。實驗室檢測人員也不能持有，解決了qPCR試劑盒的問題就解決了檢測中所有問題的非理性觀點。
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