作物產量取決于庫（sink，獲得同化物）的潛力和源（source，供給同化物）的能力，“源—庫”關系的優化對作物產量調控具有重要意義。黃瓜（Cucumis sativus L.）是世界范圍內廣泛種植的蔬菜，是我國具有巨大經濟價值的七大蔬菜之一，葉片和速生果實屬于黃瓜的“源”和“庫”器官。黃瓜是典型的棉子糖家族系列寡糖 (Raffinose family oligosaccharides, RFOs)轉運植物，DNA甲基化是植物中常見的表觀遺傳修飾，但其在庫源調控中的作用尚未在RFO轉運物種中得到證實。
 
2023年12月28日，揚州大學園藝園林學院繆旻珉教授團隊在《Plants》雜志以“The Sink-Source Relationship in Cucumber (Cucumis sativus L.) Is Modulated by DNA Methylation”為題發表研究論文，研究基于全基因組重亞硫酸鹽測序（whole-genome bisulfite sequencing）繪制了不同庫（sink）強度黃瓜葉片的表觀遺傳基因組圖譜，分析了DNA甲基化在黃瓜植物中如何影響“源—庫”關系，進而可能影響植物產量。

標題：The Sink-Source Relationship in Cucumber (Cucumis sativus L.) Is Modulated by DNA Methylation（黃瓜的源庫關系受DNA甲基化調控）
時間：2023-12-28
期刊：Plants
影響因子：IF 4.5
平臺：WGBS、RNA-seq等

研究摘要：
本研究通過全基因組（WGBS-seq）比較了兩種處理下的葉片：第12節點的非結果節葉（Nonfruiting-Node Leaves，NFNL）和坐果葉（leaves of fruit setting，FNL）。在這兩種處理中，其他節的雌性花均去除。研究結果揭示了大量差異甲基化基因在光合作用和碳水化合物代謝過程中富集。FNLs和NFNLs之間的比較轉錄組分析表明，許多具有差異甲基化區域的差異表達基因（DEGs）參與生長素/乙烯和油菜素內酯的代謝、蔗糖代謝、以及與庫源調控相關的RFO合成通路。此外，5-aza-dC-2'-脫氧胞苷（5-aza-dC，一種DNA甲基轉移酶抑制劑）處理FNLs后，葉片中上述通路中6個庫源相關基因的DNA甲基化水平降低，RFO合成通路中的棉子糖合成酶（CsSTS）基因表達、酶活性和棉子糖含量上調，從而增加果實長度和干重。本研究結果為DNA甲基化在庫源關系中的潛在作用提供了最新的推斷，這將為進一步探索DNA甲基化在提高RFO轉運植物產量中的分子機制提供重要參考。
 
研究結果
（1）非結果節葉（NFNLs）和坐果葉（FNLs）全基因組中重亞硫酸鹽測序（WGBS）的動態DNA甲基化圖譜
圖1：FNL和NFNL中全基因組DNA甲基化模式和差異甲基化區域（DMR）數量。

1. 黃瓜葉片FNLs和NFNLs表型。
2. CG、CHG和CHH平均DNA甲基化水平。
3. CG/CHG/CHH基因元件甲基化水平特征。
4. CG、CHG和CHH中差異甲基化區域（DMR）數量。
5. CG/CHG/CHH中CDS中下游2 kb、外顯子、基因體、基因間和上游2 kb的DMR數量。

（2）差異甲基化基因（DMGs）的GO分析

圖2：黃瓜FNLs和NFNLs之間差異甲基化基因（DMGs）的GO富集分析。

1. 在CG背景下差異甲基化基因（DMG）的GO富集。
2. 在CHH背景下DMG的GO富集。

（3）FNLs和NFNLs之間DNA甲基化與基因表達的相關性

圖3：與庫源調控相關的代謝通路中差異甲基化區域和差異表達基因的比較分析。

1. 生長素；
2. 乙烯；
3. 油菜素內酯（BR）的生物合成和代謝途徑。

AUX1：生長素流入載體（AUX1-LAX家族）；IAA：生長素反應蛋白IAA；ARF：生長素反應因子；SAUR：SAUR家族蛋白；GH3：生長素反應性GH3基因家族；ERF1：乙烯反應轉錄因子1；ETR：乙烯受體[EC:2.7.13.-]；EBF1/2：EIN3結合F-box蛋白；SIMKK：絲裂原活化蛋白激酶4/5[EC:2.7.12.2]；BRI1：蛋白質油菜素類固醇不敏感1[EC:2.7.10.1 2.7.11.1]；BSK：BR信號激酶[EC:2.7.11.1]；BAK1：油菜素類固醇不敏感的1相關受體激酶1[EC:2.7.10.1，2.7.11.1]；BZR1/2：油菜素類固醇抗性1/2；CYCD3：細胞周期蛋白D3，植物；TCH4，木葡聚糖：木糖基轉移酶TCH4[EC:2.4.1.207]。
D.   蔗糖代謝通路。SUS：蔗糖合酶[EC:2.4.1.13]；INV：β-呋喃果糖苷酶[EC:3.2.1.26]；TPS：海藻糖6-磷酸合酶[EC:2.4.1.15；2.4.1.347]；TPP：海藻糖6-磷酸磷酸酶[EC:3.1.3.12]。
E.   RFO合成通路。GALE：UDP-葡萄糖4-差向異構酶[EC:5.1.3.2]；SPS：蔗糖磷酸合酶[EC:2.4.1.14]；SPP：蔗糖磷酸酶[EC:3.1.3.24]；GolS：半乳糖醇合酶[EC:2.4.1.123]；RS：棉子糖合酶[EC:2.4.1.82]；STS：棉子糖合成酶[EC:2.4.1.67]。綠色框表示該基因被DMR修飾。熱圖顯示了RNA-seq中NFNL和FNL中差異表達基因（DEG）表達水平。Log2（FNL/NFNL）代表基因倍數變化，其中FNL/NFNL是指FPKM reads比率。


圖4：DNA甲基化富集與NFNLs和FNLs之間庫源調控相關基因表達水平之間的相關性。

1. 左側和右側的縱坐標分別表示CHH背景下的DNA甲基化水平和NFNL和FNL之間的相對表達水平。數據表示為RT-qPCR中的平均值±SD（n=3）。
2. DNA甲基化敏感的限制性核酸內切酶消化，然后進行PCR（Chop-PCR）驗證NFNL和FNL之間的DNA甲基化水平。ClaI、AvaI、DpnI、SnaBI、FspEI和HpaII是甲基化敏感的限制性內切核酸酶。未消化的DNA擴增用作對照。

 
（4）5-Aza-dC對庫源關系的作用
圖5：5-aza-dC-2'-脫氧胞苷（5-aza-dC）處理后FNL中胞嘧啶-5 DNA甲基轉移酶（C5-MTase）和DNA去甲基化酶（dMTase）的表達譜。

1. FNLs上5-Aza-dC處理組和對照組的果實表型表征。
2. 擬南芥和C.sativus的dMTase基因之間關系的系統發育樹。不同顏色的圓圈代表不同的物種。I和II代表兩個亞科。
3. 擬南芥和C.sativus的C5 MTase基因之間關系的系統發育樹。I–III代表三個亞科。
4. 用和不用5-Aza-dC處理的FNL中甲基轉移酶基因和去甲基化酶基因的表達分析。

數據表示為RT-qPCR中的平均值±SD（n=3）。星號表示相對于CK組的顯著差異（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，使用學生t檢驗）。
 圖6：葉片庫源相關基因的表達譜和DNA甲基化水平以及FNLs上5-Aza-dC處理后的果實表型表征分析。

1. 通過Chop-PCR分析FNL和對照組的5-Aza-dC處理之間的DNA甲基化狀態。
2. CsGolS1、CsRS和CsSTS在FNLs中的相對表達水平。
3. FNL中cSGOL、cSR和cSST的酶活性。
4. FNLs的可溶性糖含量。
5. 果實長度。
6. 果實干重。

數據表示為平均值，圖（B–D）中三個重復的標準偏差（SD）和圖（E，F）中五個重復的標準偏差（SD）。誤差線表示三/五個生物學重復之間的標準偏差。星號表示相對于CK組的顯著差異（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，使用學生t檢驗）。
 
研究結論
源庫之間的光合產物分配是黃瓜產量的重要決定因素。本研究首次深入了解了黃瓜不同庫強度下的表觀遺傳譜。甲基化組和轉錄組分析結果表明，DEGs參與生長素/乙烯和油菜素內酯的生物合成和代謝、蔗糖代謝，以及RFO合成通路受DNA甲基化調控。此外，經5-Aza-dC處理的坐果葉（FNLs）促進了果實生長。5-Aza-dC上調了CSST的相對表達，CSST酶活性和參與葉片同化物負荷的棉子糖含量，表明5-Aza-dC在庫源調控中的重要作用。這項研究揭示了DNA甲基化對庫源關系的貢獻，并提出了通過改變DNA甲基化來提高黃瓜產量的可能性。

參考文獻：Wang Y, Zhang H, Gu J, Chen C, Liu J, Zhang Z, Hua B, Miao M. The Sink-Source Relationship in Cucumber (Cucumis sativus L.) Is Modulated by DNA Methylation. Plants (Basel). 2023 Dec 28;13(1) pii: plants13010103. doi: 10.3390/plants13010103. PubMed PMID: 38202411.