利用Scn5a 的體內堿基編輯技術實現對長QT綜合征小鼠模型的基因治療
遺傳性心律失常是死亡的一個重要原因，導致心臟性猝死的比例高達 12% 至 20%。編碼心臟離子通道和相關蛋白的基因中的致病性變異 (PV) 會損害其轉錄、組裝、運輸和門控， 導致長 QT 綜合征 （LQTS）類型（LQT1、LQT2 和 LQT3）、 短 QT 綜合征、 Brugada 綜合征、兒茶酚胺多形性室性心動過速和病竇綜合征。雖然有預防心律失常和心源性猝死的方法，但它們往往還會引起副作用。如β-受體阻滯劑在臨床上用于治療 LQTS， 但心血管事件和猝死仍然會發生。因此，對該疾病的永久治療確實存在未滿足的需求。迄今為止，預防遺傳性心律失常最有前途的治療策略是通過使用基因編輯工具直接靶向突變基因來消除遺傳性基因損傷。
編碼心臟鈉通道α亞基（Nav1.5）的基因Scn5a發生變異是該類疾病產生的原因之一，稱為3型長QT綜合征（LQT3）。為了研究堿基編輯工具對LQT3的治療作用，近日，中國醫學科學院阜外醫院蘭峰教授、復旦大學王永明教授等團隊，在頂刊《Circulation》發表了題目為“In vivo base editing of Scn5a rescues type 3 long QT syndrome in mice” 的相關研究論文，在這項研究中利用Scn5a的體內堿基編輯技術實現對長QT綜合征小鼠模型的基因治療。
文中采用熒光標測技術（Optical Mapping，MappingLab，UK）檢測不同小鼠模型的動作電位信號，清晰描繪出各組模型的心臟動作電位各項指標的變化。同時采用全細胞膜片鉗檢測了不同模型組離體心室心肌細胞的動作電位和鈉電流的變化。
結果：
1.構建LQT3小鼠模型
在本研究中，使用雙腺相關病毒血清型9（AAV9） 傳遞腺嘌呤堿基編輯器 ABE (ABE max31) 對 Scn5a 進行堿基編輯（圖1），將患者的致病突變T1307M引入到小鼠的Scn5a基因上，構建了攜帶Scn5a T1307M致病性變異的LQT3小鼠模型。小鼠模型表現出LQT3患者的心電圖特征-QT及QTc延長。另外，在卡巴膽堿降低心率后，小鼠模型心臟竇性停搏增加；同時卡巴膽堿可誘導純合小鼠模型產生室性心動過速（圖2）。
圖1.通過堿基編輯器對出生后小鼠心臟中的 Scn5a 基因組進行編輯
圖2.攜帶Scn5a T1307M致病性變異的LQT3小鼠模型的生成
同時還對小鼠模型離體心臟進行了光學標測，結果顯示，與 WT 小鼠相比，心室傳導無差異，但雜合子和純合子 T1307M 小鼠的心室動作電位時程 APD90顯著延長，APD30 / APD80比率增加（圖 S8）。當從心尖給予 8 Hz 刺激時，獲得了一致的結果。然后，我們通過全細胞膜片鉗檢測了離體心室心肌細胞的動作電位和鈉電流。與 WT 肌細胞相比，Scn5a T1307M心肌細胞的晚期鈉電流密度顯著增加，都體現了人類LQT3的疾病表型。以上結果說明模型構建成功。
圖S8. 自發節律下離體心臟的光學標測
2. ABE 對 Scn5a T1307M 的體內校正并減輕了LQT3表型
T1307M突變是由堿基C變成T形成的。ABE堿基編輯器能將T轉變成C，進而糾正堿基突變。實驗中采用反式剪接將ABE分成兩段后，利用AAV9送到小鼠體內。單次腹腔注射AAV9-ABE 病毒可以實現~40%的DNA糾正及~70%的mRNA糾正。而AAV9主要是感染心肌細胞，Scn5a主要在心肌細胞中表達，所以在Scn5a mRNA水平的糾正效率高。這些發現表明 ABE 可以有效糾正小鼠心臟中的 Scn5a T1307M 序列變異。ABE治療還減少了雜合子和純合小鼠中由卡巴膽堿給藥引起的心竇驟停，并消除了純合子 Scn5a T1307M 小鼠中卡巴膽堿誘導的 TdP 或 VT（圖3）。以上結果說明堿基編輯技術針對心肌細胞的基因編輯治療對于電生理功能表型是有效和安全的，可以有效的減輕 LQT3 表型。
圖3. 體內堿基編輯技術減輕了 LQT3 表型。
3.T1307M小鼠堿基編輯的治療閾值及脫靶效應檢測
為了探究多高的編輯效率可以治療 LQT3 表型，研究人員向新生2周齡的雜合小鼠腹腔注射AAV9-ABE病毒。10周后，觀察到 T1307M mRNA的修正率從 23.29% 到 95.72% 不等。將mRNA修正率與 QT間期以及竇性停搏次數關聯。結果顯示隨著修正率的增加，QT及QTc間期逐漸縮短，卡巴膽堿誘導的竇性停搏次數逐漸下降（圖4），即使較低的編輯效率，也能減輕長QT的表型。
當mRNA 的修正率超過60%時，可完全消除雜合小鼠的心律失常表型。同時，在純合T1307M小鼠中，堿基編輯還消除了致命性室性心動過速（圖4）。這些結果表明編輯效率達到一定的閾值時，可以完全消除心律失常表型。
圖4.T1307M小鼠堿基編輯的治療閾值
為了評價ABE心臟治療的安全性，研究人員對基因編輯后的心臟DNA進行全轉錄組測序，測序結果并未發現明顯的DNA或RNA脫靶（圖5）。堿基編輯也沒有引發額外的心率失常。這些結果表明 ABE 是一種安全的體內心臟編輯工具。
圖5.堿基編輯器的脫靶效應檢測
圖6.總體示意圖模型
總之，這些研究表明，體內 AAV9-ABEmax 編輯可以糾正變異的 Scn5a 等位基因，有效改善心律失常表型。為遺傳性心律失常的治療提供了有效的概念性證明。
