生物制品中宿主細胞的殘留DNA標準及檢測方法

瀏覽次數：3273　發布日期：2023-12-25　來源：本站　僅供參考，謝絕轉載，否則責任自負

生物制品是指以微生物、細胞、動物或人源組織和體液等為起始原材料，用生物學技術制備，用于預防、治療和診斷人類疾病的制劑。當前，隨著越來越多的生物制品進入治療領域，于是生物制品與之俱來的生物安全性問題被漸漸提上日程，生物制品的質量控制也日趨嚴格。其中宿主細胞殘留核酸由于可能會傳遞腫瘤或病毒相關基因，存在潛在致癌性和感染性風險。各國藥品監督管理機構對生物制品中宿主細胞殘留核酸的態度謹慎且明確，要求各制藥企業建立詳細可行、靈敏度高的檢測方法，用于驗證藥品的純化過程可以去除殘留DNA，并對終產品的放行嚴格把關，避免攜帶外源DNA的藥品流入市場。

宿主細胞殘留DNA標準

各國藥品監督管理機構均對生物制品中宿主細胞DNA的殘留量進行了嚴格的限度控制以規避風險。

表1 宿主細胞殘留DNA標準

藥典	標準
中國藥典2020版	以細胞基質生產的生物制劑DNA殘留量不能超過100 pg/劑；以細菌或真菌基質生產的疫苗，其宿主DNA殘留量應≤10 ng/劑。
WHO	推薦非腸道接種成品中殘留DNA不高于10 ng/劑；口服類成品中殘留DNA不高于100ug/劑。
FDA	生物制品宿主細胞DNA殘余限度為100 pg/劑；對于大劑量生物制品如單克隆抗體，根據其殘留DNA來源及給藥途徑不同，DNA殘留量可放寬至10 ng/劑；對于選用連續非致瘤性細胞生產的生物制品成品，其DNA殘留量應控制在10 ng/劑以下，長度不大于200 bp。
歐洲藥典	規定生物制品殘留DNA限度不超過10 ng/劑

除了對宿主核酸殘留量有限度規定，我國首次對于DNA殘留片段的大小也有了明文規定：2022年，我國國家藥品監督管理局藥品審評中心發布的《體內基因治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》中提到對于生產若使用了腫瘤細胞系致瘤細胞系或攜帶有致瘤基因、病毒來源序列的細胞（如HEK 293T細胞），在確保無完整活細胞殘留的同時，需對DNA的殘留量和殘留片段大小進行控制。建議盡量將殘留DNA控制在10ng/劑以內，DNA殘留片段的大小控制在200bp以下。

表2宿主細胞殘留DNA片段風險因子

宿主細胞殘留DNA片段大小（bp）	風險因子
＜200	1
200-1000	2
＞1000	3
＞1000	4

注：片段越長，風險因子越大。

宿主細胞殘留DNA檢測方法

為確保生物制品的安全性和質量，因此建立合適的宿主細胞殘留DNA檢測方法至關重要。《中國藥典2020年版》通則3407中推薦了三種外源性DNA殘留量測定方法，包括DNA探針雜交法、熒光染色法和定量PCR法。

表3 宿主細胞殘留DNA檢測方法

方法學	DNA探針雜交法	熒光染色法	定量PCR法
檢測原理	將特異性單鏈DNA探針標記后與供試品單鏈DNA雜交，并使用與標記物相應的顯示系統顯示雜交結果，與已知含量的陽性DNA對照比對后，根據顯色的深淺判斷供試品中外源性DNA殘留量。	應用雙鏈DNA熒光染料與雙鏈DNA特異性結合形成復合物在波長480nm激發產生熒光型號，根據供試品的熒光強度，計算供試品中DNA的殘留量。	PCR反應過程中可通過熒光標記的特異性探針或熒光染料摻入而檢測PCR產物量。在反應過程中釋放的熒光強度達到閾值時,體系的PCR環數(Ct)與起始DNA板量的對數值呈線性關系。采用已知濃度的DNA標準品,構建標準曲線,對特定模板進行定量分析,測定供試品中的外源DNA殘留量。
特異性	中	低	高
靈敏度	10fg/uL	1pg/uL	1fg/uL
檢測時長	5-6h	0.5-1h	1-1.5h
檢測范圍	0.01-100pg/uL	1.25-80pg/uL	0.01-100pg/uL

其中定量PCR法因其檢測特異性高、靈敏度高、重現性好、通量高、耗時短等優點現已成為生物制品工藝研究和產品質量控制的首選檢測方法。愛必信最終選擇更準確、可靠、科學的熒光探針（TaqMan®）qPCR 法作為細胞殘留DNA檢測的方法。推出了一系列宿主細胞殘留核酸定量檢測試劑盒，能夠專一快速的對中控樣品或原液成品中宿主細胞殘留核酸進行準確定量，靈敏、準確和定量下限，能滿足病毒疫苗生產、重組蛋白藥物純化、細胞治療和疫苗研究中緩解PBMC細胞結團以及慢病毒的大規模純化等工業客戶的工藝研究和質控需求。