細胞傳代培養實驗步驟說明
傳代培養中的細胞傳代培養 (subculture)，當原代培養成功以后，隨著培養時間的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止; 另一方面也會因營養物不足和代謝物積累而不利于生長或發生中毒。當培養的細胞增殖達到一定密度后，將會出現密度抑制現象，表現為細胞的生長和分裂速度逐漸減慢，甚至停止。此時如果不及時進行分裝再培養，即傳代培養，細胞將逐漸走向衰老、死亡。將培養的細胞從一個容器以 1∶2 或其他比率轉移到其他容器中擴大培養，稱為傳代培養。貼附型生長細胞采用酶消化傳代法，而懸浮型生長細胞則采用直接傳代法或離心傳代法。
實驗步驟:
一、貼附型生長細胞的傳代貼附型生長的細胞采用酶消化的方法進行傳代。
具體步驟如下：
1. 細胞的清洗 取已長成或接近長成致密單層的 HeLa 或 T47D 細胞（或原代培養細胞）一瓶，倒去培養液，加入 2～3 mL Hanks 清洗液，輕輕振蕩漂洗細胞后傾去清洗液，以去除殘留的培養液和衰老脫落的細胞及其碎片。
2. 消化 加入適量（蓋滿細胞面即可）0.25% 胰蛋白酶溶液，室溫下（或 37℃）消化 2～3 分鐘后，倒置顯微鏡下觀察細胞面，待培養細胞變成圓形時即可快速倒去消化液（如消化程度不夠時可延長時間）；再加 Hanks 清洗液輕輕清洗一遍后傾出或直接進行下一步操作。如在酶消化過程中，見細胞大片脫落，表明消化過度，此時為避免細胞大量丟失，不應倒去消化液，而要加入等量的培養液吹打，收集細胞，800r/min 離心 5 分鐘后棄去上清液，再進入下一步。
3. 接種 在培養瓶中加入 3 mL 培養液（含 10% 血清）以終止消化。用吸管反復吹打瓶壁上的細胞層，直到全部細胞被沖下，輕輕吹打混勻，制成單細胞懸液。按 1∶2 或 1∶3 分配，接種到 2～3 個培養瓶內，再向各瓶補加培養液到 5 mL，也可以取細胞懸液計數，分別按需要的細胞濃度接種到一定數量其他的培養瓶中，再補足培養液進行培養。原代培養的細胞首次傳代時，細胞接種數量要多一些，以使細胞盡快適應新環境，利于細胞生存和增殖，隨消化分離后的組織塊也可一并傳入新的培養瓶。
4. 觀察 細胞傳代后，每天應對培養細胞進行觀察，注意有無污染、培養液的顏色變化情況、細胞貼壁和生長情況等，若細胞貼壁存活則稱為傳代一次。
二、懸浮型生長細胞的傳代因懸浮型生長細胞不貼壁，故傳代時不必采用酶消化法，而可直接傳代或離心收集細胞后傳代。
1、直接傳代
直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉 1/2～2/3，然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。
2、離心傳代
（1）、在超凈臺內用吸管將培養瓶中的細胞吹打均勻，尤其是將半貼壁的細胞吹打起來。
（2）、將細胞懸液吸入離心管中，蓋緊膠蓋，與另一離心管配平后，置離心機中 800～1000r/min 離心 5 分鐘。
（3）、回到超凈臺操作，棄上清液，加入適量新培養液，用吸管吹打均勻，制成單細胞懸液。
（4）、按 1∶2 或 1∶3 分配傳代培養，也可以計數后根據所需要的細胞濃度傳至已準備好的新培養瓶或培養皿中，放入 CO2 培養箱中繼續培養。
實驗步驟:
一、貼附型生長細胞的傳代貼附型生長的細胞采用酶消化的方法進行傳代。
具體步驟如下：
1. 細胞的清洗 取已長成或接近長成致密單層的 HeLa 或 T47D 細胞（或原代培養細胞）一瓶，倒去培養液，加入 2～3 mL Hanks 清洗液，輕輕振蕩漂洗細胞后傾去清洗液，以去除殘留的培養液和衰老脫落的細胞及其碎片。
2. 消化 加入適量（蓋滿細胞面即可）0.25% 胰蛋白酶溶液，室溫下（或 37℃）消化 2～3 分鐘后，倒置顯微鏡下觀察細胞面，待培養細胞變成圓形時即可快速倒去消化液（如消化程度不夠時可延長時間）；再加 Hanks 清洗液輕輕清洗一遍后傾出或直接進行下一步操作。如在酶消化過程中，見細胞大片脫落，表明消化過度，此時為避免細胞大量丟失，不應倒去消化液，而要加入等量的培養液吹打，收集細胞，800r/min 離心 5 分鐘后棄去上清液，再進入下一步。
3. 接種 在培養瓶中加入 3 mL 培養液（含 10% 血清）以終止消化。用吸管反復吹打瓶壁上的細胞層，直到全部細胞被沖下，輕輕吹打混勻，制成單細胞懸液。按 1∶2 或 1∶3 分配，接種到 2～3 個培養瓶內，再向各瓶補加培養液到 5 mL，也可以取細胞懸液計數，分別按需要的細胞濃度接種到一定數量其他的培養瓶中，再補足培養液進行培養。原代培養的細胞首次傳代時，細胞接種數量要多一些，以使細胞盡快適應新環境，利于細胞生存和增殖，隨消化分離后的組織塊也可一并傳入新的培養瓶。
4. 觀察 細胞傳代后，每天應對培養細胞進行觀察，注意有無污染、培養液的顏色變化情況、細胞貼壁和生長情況等，若細胞貼壁存活則稱為傳代一次。
二、懸浮型生長細胞的傳代因懸浮型生長細胞不貼壁，故傳代時不必采用酶消化法，而可直接傳代或離心收集細胞后傳代。
1、直接傳代
直接傳代即讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后，將上清液吸掉 1/2～2/3，然后用吸管吹打形成細胞懸液后再傳代。
2、離心傳代
（1）、在超凈臺內用吸管將培養瓶中的細胞吹打均勻，尤其是將半貼壁的細胞吹打起來。
（2）、將細胞懸液吸入離心管中，蓋緊膠蓋，與另一離心管配平后，置離心機中 800～1000r/min 離心 5 分鐘。
（3）、回到超凈臺操作，棄上清液，加入適量新培養液，用吸管吹打均勻，制成單細胞懸液。
（4）、按 1∶2 或 1∶3 分配傳代培養，也可以計數后根據所需要的細胞濃度傳至已準備好的新培養瓶或培養皿中，放入 CO2 培養箱中繼續培養。
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