產品及特點
虹彩病毒科宿主范圍廣泛，可感染脊椎動物和無脊椎動物，它們在水生物種中廣泛分布，可能導致大規模損失。它可感染四脊滑螯蝦（Cherax quadricarinatus）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）、日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）、克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）和粗腿厚紋蟹（Pachygrapsus crassipes）等。本產品就是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測蝦虹彩病毒的試劑盒，它具有下列特點：
■ 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
■ 引物和探針經過優化，靈敏性高。
■ 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。
■ 特異性高，引物是根據蝦虹彩病毒DNA高度保守區設計，不會跟其他微生物的DNA發生交叉反應。
■ 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。
■ 本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。
■ 本產品只能用于科研。

格及成分

成分	編號
A	190303
B	180701
C	100935
D	15-75430yp
E	75430pc
使用手冊	15-75430sc

運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為12個月。

自備試劑
樣品DNA。

使用方法
一、稀釋標準曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
■ 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
■ 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。
■ 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
■ 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
■ 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
■ 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備
■ 如果有N個樣品待提取，最好設置N+2個提取，多出的是PC（樣品制備陽性對照）和NC（樣品制備陰性對照）。可以取陽性對照的1000倍稀釋液10μL再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為PC。另外用水作為NC。
■ 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數DNA提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）
■ 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
■ 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成分/每管	樣品管 N+2個	PCR陰性對照管	標準曲線 樣品管（1-6管）
A	10 μL	10 μL	10 μL
D	3 μL	3 μL	3 μL
N+2個待測DNA模板	7 μL	-	-
C	-	7 μL	-
第6步所得標準曲線樣品稀釋液（1-6號）	-	-	7 μL（1號樣到1號管，2號樣到2號管…）

■ 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	10 min
PCR反應 （45個循環）	95℃	15 sec
	60℃	60 sec（采集FAM通道的熒光信號）

四、數據處理
■ 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品核酸濃度的log值，再推算出其濃度。
■ 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于39。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于39則為陽性。如果在39-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。