電穿孔方法進行T細胞基因編輯的瓶頸：電穿孔技術在以往研究中發現，當加入長的雙鏈DNA以及濃度非常高的情況下，會對細胞造成很高的毒性引發細胞死亡，短的單鏈DNA就不會。
 

Theo及其團隊選擇Lonza 96 shuttle高通量電穿孔系統對CRISPR與DNA的比例、細胞培養的不同方式、不同強度的電脈沖等參數進行摸索優化，很好的解決了雙鏈DNA對細胞毒性大的問題。Theo等從健康人體內獲得T細胞，利用Lonza Nucleofector技術更換了T細胞的TCR，使這些細胞能夠特異性地攻擊人黑色素瘤細胞。

 

二，新藥開發—全基因組陣列CRISPR-Cas9篩選

2019年，GSK（英國葛蘭素史克公司GlaxoSmithKline）公司與加州大學創建了基因組研究實驗室（LGR）。

SLAS2020國際會議與展覽在T細胞中進行陣列CRISPR-Cas9基因編輯篩選的384孔工作流程。

 

基于這一用于T細胞篩選的小型、穩健的高通量電轉染方案和分析，GSK成功解決了原代T細胞的轉染難題，并展示了全基因組陣列CRISPR-Cas9篩選在原代細胞轉染中的潛力。

三，新冠研究—高通量CRISPR篩選

加州大學舊金山分校的研究團隊使用Lonza 384-well Nucleofector™ 來進行陣列CRISPR篩選，以識別增強或抑制新冠病毒感染的宿主蛋白。

 

 

Comparative host-coronavirus protein interaction networks reveal pan-viral disease mechanisms[J]. Science (New York, N.Y.), 370(6521):eabe9403.

四，新冠研究—高通量CRISPR篩選

巴斯德研究所的研究團隊同樣應用到了Lonza 384-well Nucleofector™ 系統進行高通量的CRISPR/Cas9篩選，評估了1905個ISG（IFN stimulated genes）在人肺上皮細胞中調節SARS-Cov-2復制的能力。
 

 

 

Mac Kain, A., Maarifi, G., Aicher, S. et al. 2021. Identification of DAXX As A Restriction Factor Of SARS-CoV-2 Through A CRISPR/Cas9 Screen.

五，siRNA篩選靶點——開發腦瘤候選藥物

丹麥癌癥協會研究中心的研究人員基于Lonza 384-well Nucleofector™ 系統進行了高通量siRNA文庫篩選，采用的siRNA庫包含296個基因靶點，陽性對照（INCENP9）和陰性對照(siRNA的加擾對照)，每個基因設計了3個獨立的 siRNA。基于此，研究人員發現了膠質母細胞瘤的潛在靶點——SPT6，并證實了SPT6丟失誘導的DNA雙鏈斷裂（DSB）是膠質母細胞瘤特異性的。
 

 

 

Obara E , Aguilar-Morante D , Rasmussen R D , et al. SPT6-driven error-free DNA repair safeguards genomic stability of glioblastoma cancer stem-like cells[J]. Nature Communications, 2020, 11(1):4709.

六，原代細胞轉染——特發性肺纖維化治療

阿斯利康采用Lonza原代細胞，IPF肺成纖維細胞，探索了IPF(特發性肺纖維化Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)的關鍵疾病驅動機制。在這項研究中，Lonza 384-well Nucleofector™ 系統成功對原代健康人類肺成纖維細胞的第2代細胞進行了CRISPR-Cas9 RNP轉染遞送。研究結果證明了PPP1R15A在調節肺間充質細胞中的主要作用，并且提示了特發性肺纖維化的一種新治療策略。
 

 

 

Monkley S , Overed-Sayer C , Parfrey H , et al. Sensitization of the UPR by Loss of PPP1R15A Promotes Fibrosis and Senescence in IPF[J]. Scientific Reports.

七，多質粒的高通量電穿孔，優化CRISPR堿基編輯

上海交通大學童垚俊教授團隊開發了一種基于CRISPR-Prime編輯技術的通用（無雙鏈斷裂）原核生物遺傳操作工具箱，通過Lonza 384-well Nucleofector™ 系統進行高通量的多質粒電穿孔，實現了大腸桿菌的質粒和染色體的基因敲除、敲入、敲低、單堿基替換和組合編輯。
 

 

 

Tong, Y., Jørgensen, T.S., Whitford, C.M. et al. A versatile genetic engineering toolkit for E. coli based on CRISPR-prime editing. Nat Commun 12, 5206 (2021)