本文要點：多重熒光成像主要應用于細胞成像，NIR區(qū)域的多色熒光成像能夠可視化體內(nèi)的各種生物過程，適用于機制研究、疾病診斷和成像引導手術(shù)，可提供體外成像無法獲得的信息。傳統(tǒng)上，多重熒光成像可以通過使用共同激發(fā)波長、不同檢測通道，然后進行光譜分解來完成。然而，由于NIR區(qū)域的分辨率和對比度各異，每個檢測通道的分辨率將有顯著差異。可以通過多路復用激發(fā)和單通道檢測以避免該問題，使所有窗口具有一致的分辨率和對比度。為了實現(xiàn)多路復用成像，非常需要具有良好間隔的吸收和發(fā)射光譜的NIR-II熒光探針相互匹配，可以用單獨的激發(fā)波長激發(fā)并在相同的NIR-II發(fā)射波長中檢測。
 

目前，大多數(shù)近紅外熒光探針具有較小的斯托克斯位移、突出的自猝滅特性，并且傾向于流出細胞，不利于體內(nèi)高對比度的細胞跟蹤。因此，迫切需要開發(fā)具有長發(fā)射波長、大斯托克斯位移、優(yōu)異的抗猝滅能力且在細胞中停留時間長的近紅外熒光團。

鑒于此，本研究開發(fā)了兩種菁染料：FNIR-1090和IR-765，其中FNIR用于標記癌癥細胞，在近紅外II區(qū)（NIR-II）進行多路激發(fā)和單通道檢測，用于體內(nèi)雙色成像（方案1）。

方案1. 雙色體內(nèi)熒光成像和使用FNIR-1090標記癌癥細胞

FNIR-1090是在Pr-1099衍生物上通過SRN1置換反應與1-乙基哌嗪連接而構(gòu)建的，在連續(xù)808nm激光照射下顯示出優(yōu)異的量子產(chǎn)率（0.074%）和令人滿意的光穩(wěn)定性。IR-765是通過Vilsmeier-Haack試劑與2-（3,5,5-三甲基環(huán)己-2-亞苯基）丙二腈（TEMO）的一步反應合成的，在連續(xù)660nm激光照射下具有高效的光穩(wěn)定性、良好的生物相容性、高量子產(chǎn)率（6.7%）和優(yōu)異的抗光漂白性能。盡管IR-765發(fā)射最大值不在NIR-II區(qū)域，但極好的熒光亮度使其熒光發(fā)射尾部在NIR-II成像系統(tǒng)中很容易被檢測到。

圖1. FNIR-1090（a）和IR-765（b）的吸收與發(fā)射光譜

使用NIR-II成像系統(tǒng)研究兩種探針在不同介質(zhì)（DMSO，4%吐溫-20/PBS，1×PBS緩沖液和4T1細胞懸浮液）中的串擾。發(fā)現(xiàn)FNIR-1090和IR-765在不同介質(zhì)中都保持了明顯的熒光信號，不會相互干擾。

圖2. FNIR-1090和IR-765在不同介質(zhì)中的串擾

在含10% FBS的PBS溶液中，IR-765和FNIR-1090分別在660nm和808nm激光連續(xù)照射1小時后，相對熒光強度沒有明顯變化，表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。在37℃孵育下，F(xiàn)NIR-1090的相對熒光強度相當穩(wěn)定。而IR-765的熒光信號在3小時后達到最大值，然后保持相對恒定，可能是由于IR-765和FBS蛋白內(nèi)部疏水結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導致熒光強度增高。

圖3. FNIR-1090和IR-765的光穩(wěn)定性和化學穩(wěn)定性

將IR-765腹腔注射到小鼠體內(nèi)，然后將FNIR-1090標記的4T1細胞靜脈注射到小鼠體內(nèi)，用于體內(nèi)雙色成像。如圖4，探針分布清晰可見，IR-765和FNIR-1090的信噪比分別約為3.5和2.6，光學串擾可以忽略不計。IR-765和FNIR-1090顯示出優(yōu)異的體內(nèi)雙色NIR-II成像能力，高對比度雙通道成像可以對不同的組織進行清晰的區(qū)分，促進對深層組織進一步的探索，以獲得多路信息。

圖4. 小鼠體內(nèi)多重熒光成像

總之，本研究設(shè)計并合成了兩種新型菁基熒光探針（FNIR-1090、IR-765），用于體內(nèi)實時雙色近紅外成像。兩種探針吸收光譜幾乎完全分離，熒光串擾可忽略不計，且表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性、化學穩(wěn)定性、大斯托克斯位移，以及良好的組織穿透能力和高分辨率，是可用于生物醫(yī)學開發(fā)的優(yōu)質(zhì)NIR-II區(qū)熒光染料。

參考文獻

Huixian Jia, Yujie Liu, Wei Tang, Chenghui Liu, Xinrui Duan, Near-infrared fluorescent probes for non-invasive, real-time, and dual-color in vivo NIR-II imaging, Sensors and Actuators B: Chemical. 396 (2023) 134595.

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