無有機溶劑的乳脂去除試劑盒使用說明書
描述：
本試劑盒用于新鮮或冷凍的柔軟植物組織進行細胞組分分離。與其他商用試劑盒以及實驗室常用方法不同，不需要大量起始材料（幾克）和較長時間的。本試劑盒僅使用 100-200 毫克的起始材料，通過使用離心管柱技術配合特有專用緩沖系統，1 小時左右可將樣品分離成胞漿、細胞核、葉綠體和微粒體四個組分。分離的組分可用于多種應用，包括但不限于蛋白質轉運研究、核蛋白提取和核酸純化/測序。分離出的高純度核可用于蛋白質組學、流式細胞術分析、DNA 測序、蛋白質-蛋白質和蛋白質-DNA 相互作用研究。分離原理：研磨組織以釋放植物細胞，然后快速通過離心管柱破壞細胞膜，通過差速離心得到不同的細胞組分。只需使用臺式離心機即可。該試劑盒已被驗證用于多種樣品，如擬南芥、菠菜、豌豆和油菜等。
試劑盒組分(20T):
1. 緩沖液 A 30ml
2. 緩沖液 B 1ml
3. 緩沖液 C 25ml
4. 離心管柱和收集管 20 套
5. 1.5ml 離心管專用研磨杵 2 根
6. 研磨粉 2g
所需附加材料（試劑盒中未提供）
臺式離心機（所有離心步驟均需在 4-8 度進行） 1X PBS
用 1 X PBS 配制的 5% BSA (流式實驗時準備) 1.5ml 離心管
運輸及儲存：常溫運輸，4 度儲存
操作方法：
注意：開始前仔細閱讀整個操作說明。建議在使用前將蛋白酶抑制劑加在緩沖液 A 和 PBS 中（蛋白酶抑制劑終濃度為 1x，例 100x 蛋白酶抑制劑，1ml 緩沖液 A 液中加 10ul 蛋白酶抑制劑）。本試劑盒操作體系最低可降至 50mg 起始樣本。緩沖液 A 和緩沖液 B 使用前需冰上預冷。
1. 將 100-150mg 新鮮/冷凍的植物嫩葉加到離心管柱套管中，折疊卷曲葉片將其塞入到離心管柱中。加入100ul 緩沖液 A，用 200ul 吸頭按壓葉片 100-200 次以壓縮葉片體積（此步大概需要 2-3min）。
2. 用研磨棒的平頭端反復向下按壓扭轉研磨 100-200 次（大約 2-3min）。（注意：研磨棒可重復使用，用 70%酒精擦拭或用蒸餾水沖洗干凈，用紙巾擦干即可。）
3. 再加 300ul 緩沖液 A 到離心柱中，用 200ul 吸頭將樣品攪拌混勻。蓋上蓋子，1,500Xg 離心 5min。（可選優化：離心后，將接收管中 200ul 上清轉回離心管柱上重復研磨，可增加最終產量）。棄去離心管柱，如需分離胞漿及微粒體組分，將收集管中的上清轉移到一個新的 1.5ml 離心管中放到冰上備用（見下面 4A步驟，如不分離可棄掉），沉淀用 1ml 預冷的 PBS 吹打重懸，然后 1,200Xg 離心 5min。棄掉上清，加入1ml 緩沖液 A 吹打重懸沉淀，同時添加 20ul 緩沖液 B，大力渦旋振蕩 10-20s，確定沉淀完全復溶用于完整的細胞核分離（見 4B 步驟）。
以下操作步驟根據實驗需求選擇，如需分離胞漿及微粒體組分，從 4A 步驟開始，如僅需細胞核組分，從 4B步驟開始。
4A. 分離細胞漿和微粒體組分：
第 3 步所得上清 4,000Xg 離心 10min（沉淀主要為破碎的葉綠體）。將上清轉移到一個新的 1.5ml 離心管中，16,000Xg 離心 30min。（上清是胞漿組分，沉淀是已經去除大部分細胞核及葉綠體的微粒體組分即：細胞器和質膜組分）
4B. 分離細胞核:
a. 將第 3 步重懸的沉淀在冰上孵育 5min，1,200Xg 離心 5min。
b. 完全去除上清，沉淀用 200ul 預冷的 PBS 移液器上下吹打 30-40 次重懸備用。
c. 將 1.2ml 緩沖液 C 加到一個新的 1.5ml 離心管中，將步驟 b 中 PBS 重懸的沉淀用移液器小心貼著管壁緩慢吹出到 C 液上方。
d. 1,200Xg，離心 5min，離心后清晰可見一個白色或淺綠色沉淀以及綠色上清。將上清完全去除干凈，用 0.5ml 預冷 PBS 清洗沉淀（沉淀為分離的完整細胞核）。細胞核可以根據下游實驗復溶在合適的溶解液中。例如：蛋白抽提實驗，可以將核用 50-100ul 含有表面活性劑的裂解液裂解，得到的蛋白可以進行 WB 檢測，ELISA 或者 IP（詳見下表以及技術說明）。測定蛋白濃度，推薦使用 BCA 法。如果下游是做流式檢測分析可以用 0.2-0.5ml 含 5%BSA 的 PBS 重懸細胞核。核酸提取，可用 Tris 緩沖液或者其他合適的細胞核緩沖液重懸。
技術說明：
1. 本試劑盒對幼嫩的植物葉片最有效，但也適用于其他軟組織，如種子、外殼和軟莖。對于非葉片軟組織，將其切割成 1 x 1 mm 或更小的碎片，按照操作步驟進行即可。非葉片組織獲取的細胞核的純度通常不如葉片組織。在大多數情況下，主要污染物是質體（plastids）而不是葉綠體。
2. 如果分離的細胞核有明顯的綠色，用 0.5ml PBS 加 20ul 緩沖液 B 重懸細胞核，冰上孵育 10min，1,000Xg離心 5min 收集清洗過的細胞核。
3. 說明書中樣品起始量對于大多數樣品而言得率是足夠的。樣品不要超過200mg，并非樣品越多結果越好。
4. 從分離的細胞核沉淀中提取蛋白，如使用 WA-009 溶解液（參照下面表格），加入 50ul 蛋白溶解液后，需加入 40-50mg 試劑盒中提供的蛋白分離粉到管底部，用試劑盒中研磨棒尖頭端用力研磨 100-200 次。再補加 50ul WA-009 溶解液，8,000Xg 離心 5min，上清為分離出來的核蛋白溶液。蛋白得率通常在 20-50ug/樣品。如果需要更多的蛋白，可將多管分離的核合并在一起再提取蛋白即可。
推薦按照下游實驗應用選購以下蛋白溶解液
產品名稱 貨號 下游實驗應用
變性蛋白溶解液 WA-009 1D 或者 2D 電泳，WB，胰酶消化，如果是做
2DE，需要在跑膠前將蛋白進行 TCA 沉淀處理。
非變性蛋白溶解液 WA-010 ELISA，IP，CO-IP，凝膠移位分析，酶活性檢測
等其他應用
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