Vero細(xì)胞是生物醫(yī)藥領(lǐng)域中制備病毒載體和疫苗最常用的細(xì)胞系，基于微載體的灌流培養(yǎng)工藝是較為常用的生產(chǎn)方式，對(duì)較高微載體投放濃度條件下灌流工藝的建立必不可缺。

本文主要利用高密度微載體灌流工具在較小體積的CloudReady™云平臺(tái)生物反應(yīng)器上進(jìn)行Vero細(xì)胞高密度灌流培養(yǎng)及消化轉(zhuǎn)移工藝的探索，建立縮小模型。

方法與結(jié)果

使用CloudReady™（500 mL）云平臺(tái)生物反應(yīng)器（圖1）和自行設(shè)計(jì)的灌流裝置完成Vero細(xì)胞在Cytodex 1 微載體上的高密度灌流培養(yǎng)。

攪拌槳葉使用多葉槳（低剪切力），攪拌方向?yàn)樯蠐P(yáng)式。

灌流工具安裝于反應(yīng)器內(nèi)部，通過管路與外部進(jìn)、出液瓶連接。

圖1  CloudReady™云平臺(tái)生物反應(yīng)器

實(shí)驗(yàn)工藝參數(shù)設(shè)置如表1所示。

溫度由半導(dǎo)體Peltier模塊的加熱和制冷實(shí)現(xiàn)無(wú)水控溫。

DO由空氣和氧氣的通氣速率級(jí)聯(lián)控制。

pH由二氧化碳的通氣速率和堿液（0.5 M NaOH）的流加速率級(jí)聯(lián)控制。其中，進(jìn)氣模式均為底部通氣。在完整的培養(yǎng)周期中，各參數(shù)控制均可靠且穩(wěn)定（圖2）。
 

圖2  培養(yǎng)過程中溫度、pH、DO參數(shù)控制穩(wěn)定性

Day 3時(shí)開始以2VVD的灌流速度進(jìn)行灌流，在Day 8即灌流培養(yǎng)5天后細(xì)胞密度達(dá)到7.82×10⁶cells/mL，微載體上細(xì)胞密度變化如圖3所示。
 

圖3 微載體上細(xì)胞密度變化曲線

由每天取樣鏡檢圖像（圖4）可見，Day 1-2時(shí)細(xì)胞在微載體上貼附較為均勻，Day 3-5細(xì)胞快速增殖鋪板滿微載體表面，空球率低，Day 6-8細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)至較滿的狀態(tài)。整個(gè)培養(yǎng)過程中灌流裝置未出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象，細(xì)胞增殖13倍。

在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，使用胰蛋白酶-EDTA (0.25%) 進(jìn)行消化，細(xì)胞收率64%，活率100%，將收獲所得細(xì)胞重新接種到原微載體上進(jìn)行批次培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁及增殖性能正常（圖4）。
 

圖4 每24 h及消化轉(zhuǎn)移取樣鏡檢圖

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該高密度灌流培養(yǎng)及逐級(jí)消化轉(zhuǎn)移工藝可行性較高，為后續(xù)更高微載體投放密度及逐級(jí)放大工藝的建立提供了縮小模型的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，也為實(shí)際規(guī)模化生產(chǎn)過程中種子細(xì)胞的批量制備提供了可嘗試的方法。
 

圖5  CloudReady™云平臺(tái)生物反應(yīng)器

CloudReady™云平臺(tái)生物反應(yīng)器（圖5）應(yīng)用靈活，可實(shí)現(xiàn)各類貼壁或懸浮細(xì)胞高密度培養(yǎng)，進(jìn)行批次、補(bǔ)料、灌流等多種生物工藝的開發(fā)和優(yōu)化，在較小體系中迅速建立工藝流程，助力研發(fā)效率飛速提升。