從體外擴增能力、體內持久性等方面提升CAR-T細胞質量的方法介紹
CAR-T細胞療法作為一種新興的個體化腫瘤免疫治療方式，已經顯示出巨大的治療潛力。但是商業化運作意味著新的挑戰，對比傳統的化學藥物，“活著”的生物藥物的不確定性更大，潛在的問題和風險更大，藥企首先就要制定出一組合理的檢測規范，以確保CAR-T產品的安全性和有效性。我們今天就來認識一下該從哪些方面確保CAR-T產品的質量，讓他們更好的惠及患者。
1 CAR-T細胞的體外擴增能力
CAR-T細胞療法需要先從患者體內獲得T淋巴細胞，然后通過體外轉基因技術 transduce CAR靶向結構域。這一過程需要在細胞培養體系中得到充分的擴增，以獲得足夠的治療CAR-T細胞數量。因此，CAR-T細胞的體外擴增能力直接決定了能否獲得滿足治療需要的細胞數量。我們可以通過多次傳代培養獲得的累積細胞數、細胞擴增的倍數增加(Fold increase)以及達到設定細胞數需要的培養時間來評估CAR-T細胞產品的體外擴增能力【1】。這些指標反映了CAR-T細胞的增殖和活力,是CAR-T細胞工藝開發的關鍵性能指標之一。
Fig1：CAR-T細胞體外擴增過程
2 CAR-T細胞在體內的持久性
CAR-T細胞輸注入體內后的存活時間和持久性也是功能的重要衡量指標。持久存活的CAR-T細胞可以發揮更持久的腫瘤殺傷作用。我們通常通過流式細胞術定期檢測外周血CAR-T細胞的數量變化來評估其在體內的持久性。一般輸注后1-6個月甚至更長時間都可持續檢出，檢出峰值一般出現在輸注后1-2周，峰值后的CAR-T細胞數量隨時間遞減是正常的【2】。理想的CAR-T細胞制劑應具有至少3-6個月的體內存活時間，這樣才可以保證達到滿意的治療效果。
3 CAR-T細胞的腫瘤靶向性能
CAR-T細胞治療的關鍵機制在于經過改造，T淋巴細胞獲得了高親和力識別腫瘤表面特異性抗原的能力，所以CAR-T細胞產品必須明確具備這種靶向腫瘤細胞的能力。我們可以通過體外實驗，檢測CAR-T細胞對表達靶向抗原的腫瘤細胞系的殺傷作用，來判斷其靶向性能。此外，我們還可以在患者體內通過流式細胞術檢測腫瘤組織中CAR-T細胞的浸潤情況，看其是否能高效進入腫瘤部位發揮殺傷功能【3】，理想的CAR-T細胞應高度富集于腫瘤處。
4 CAR-T細胞的細胞毒活性
CAR-T細胞識別腫瘤并激活后，會釋放各種細胞因子和細胞毒顆粒來攻擊和殺傷腫瘤細胞。所以我們可以檢測CAR-T細胞釋放的IFN-γ、腫瘤壞死因子-α、穿孔素、顆粒酶等水平，來評價其毒殺腫瘤的細胞毒活性以及活化狀態【4】。體外我們可以通過共培養CAR-T細胞和靶腫瘤細胞,檢測上述細胞因子和毒素的含量。脫顆粒實驗也可以直觀反映CAR-T細胞釋放穿孔素和顆粒酶的水平，這些都是評價CAR-T細胞產品殺傷活性的重要指標。
5 CAR-T細胞的記憶能力
理想的CAR-T細胞還應具有記憶功能，也就是重復激活后能夠取得更強的活性，更快地響應腫瘤信號【5】。我們可以在體外通過多次刺激CAR-T細胞，檢測其產生記憶效應，如細胞因子釋放水平提高，殺傷活性增強。這種獲得記憶能力的CAR-T細胞輸注體內后，可實現對腫瘤更持久更強勁的殺傷作用。
Fig5：CAR-T細胞長久持久性檢測
6 CAR-T細胞治療的安全性評價
CAR-T細胞治療的主要風險在于可能引發嚴重的細胞因子釋放綜合征。所以我們需要檢測CAR-T細胞產生的與CRS相關的細胞因子如IL-6、IL-10和IFN-γ的水平，評估CAR-T細胞治療可能引起CRS的風險。此外還需要監測其它可能的毒副反應【6】。
這些指標可以全方位反映CAR-T細胞的關鍵性能，包括增殖能力、腫瘤靶向性、細胞毒活性、持久性和安全性等。只有同時滿足上述指標要求的CAR-T細胞產品，才可能在臨床中發揮出真正的抗腫瘤療效。因此，開發高活性高質量的CAR-T細胞產品，必須建立科學合理的質量評價體系，掃除在發展即用型產品道路上的障礙，才能在未來實現降低成本和提高治療效果的長遠目標，惠及更多亟需治療的患者。
明星產品推薦
CAR-T療法作為時下最熱門的明星療法，緊隨國內第三款CAR-T產品獲批上市，相關CAR-T企業和平臺紛紛加速研發步伐，積極著眼于差異化布局。未來相關企業除競逐產品安全性能，降本增效將勢在必行，國產替代也將成為產業發展的主要途徑。免疫磁珠作為CAR-T細胞制備的重要物料，在T細胞分選/激活環節扮演著相當重要的角色。同立海源生物GMP級產品ActSep® CD3/CD28分選激活磁珠（貨號：GMP-TL603）集分選和激活功能于一體，高效實現T細胞的分選、激活和擴增，適合于人T細胞、CAR-T等多種T細胞培養技術的應用，并且該產品已完成美國FDA的DMF II型備案（備案號：038124），支持細胞藥物注冊申報。
T細胞耗竭水平
不同的磁珠添加比例下，T細胞激活培養14天后檢測LAG3和PD1的表達水平， ActSep®與競品基本持平，3：1的磁珠與細胞比例下，ActSep®耗竭指標表達更低。此外，在Day 5去除磁珠，將進一步降低T細胞的耗竭水平。
T細胞亞型分析
檢測ActSep®分選激活后，不同培養時間點T細胞亞型的變化。Tcm占比在培養過程中升高，隨著培養時間延長Teff與Tem比例有所升高。
參考文獻：
【1】 Levine BL, Miskin J, Wonnacott K, Keir C. Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016 Dec 31;4:92-101.
【2】 Biasco L, Izotova N, Rivat C, Ghorashian S, Richardson R, Guvenel A, Hough R, Wynn R, Popova B, Lopes A, Pule M, Thrasher AJ, Amrolia PJ. Clonal expansion of T memory stem cells determines early anti-leukemic responses and long-term CAR T cell persistence in patients. Nat Cancer. 2021 Jun;2(6):629-642.
【3】 Watanabe Y, Tsukahara T, Murata K, Hamada S, Kubo T, Kanaseki T, Hirohashi Y, Emori M, Teramoto A, Nakatsugawa M, Yamashita T, Torigoe T. Development of CAR-T cells specifically targeting cancer stem cell antigen DNAJB8 against solid tumours. Br J Cancer. 2023 Mar;128(5):886-895. doi: 10.1038/s41416-022-02100-1. Epub 2022 Dec 16. PMID: 36526673; PMCID: PMC9977765.
【4】 Hu Q, Li H, Archibong E, Chen Q, Ruan H, Ahn S, Dukhovlinova E, Kang Y, Wen D, Dotti G, Gu Z. Inhibition of post-surgery tumour recurrence via a hydrogel releasing CAR-T cells and anti-PDL1-conjugated platelets. Nat Biomed Eng. 2021 Sep;5(9):1038-1047.
【5】 Goodman DB, Azimi CS, Kearns K, Talbot A, Garakani K, Garcia J, Patel N, Hwang B, Lee D, Park E, Vykunta VS, Shy BR, Ye CJ, Eyquem J, Marson A, Bluestone JA, Roybal KT. Pooled screening of CAR T cells identifies diverse immune signaling domains for next-generation immunotherapies. Sci Transl Med. 2022 Nov 9;14(670):eabm1463.
【6】 《CD19 CAR-T治療B-NHL毒副作用臨床管理中國專家共識（2022）》
1 CAR-T細胞的體外擴增能力
CAR-T細胞療法需要先從患者體內獲得T淋巴細胞，然后通過體外轉基因技術 transduce CAR靶向結構域。這一過程需要在細胞培養體系中得到充分的擴增，以獲得足夠的治療CAR-T細胞數量。因此，CAR-T細胞的體外擴增能力直接決定了能否獲得滿足治療需要的細胞數量。我們可以通過多次傳代培養獲得的累積細胞數、細胞擴增的倍數增加(Fold increase)以及達到設定細胞數需要的培養時間來評估CAR-T細胞產品的體外擴增能力【1】。這些指標反映了CAR-T細胞的增殖和活力,是CAR-T細胞工藝開發的關鍵性能指標之一。
Fig1：CAR-T細胞體外擴增過程
2 CAR-T細胞在體內的持久性
CAR-T細胞輸注入體內后的存活時間和持久性也是功能的重要衡量指標。持久存活的CAR-T細胞可以發揮更持久的腫瘤殺傷作用。我們通常通過流式細胞術定期檢測外周血CAR-T細胞的數量變化來評估其在體內的持久性。一般輸注后1-6個月甚至更長時間都可持續檢出，檢出峰值一般出現在輸注后1-2周，峰值后的CAR-T細胞數量隨時間遞減是正常的【2】。理想的CAR-T細胞制劑應具有至少3-6個月的體內存活時間，這樣才可以保證達到滿意的治療效果。
Fig2：CAR-T細胞體內持久性相關檢測
3 CAR-T細胞的腫瘤靶向性能
CAR-T細胞治療的關鍵機制在于經過改造，T淋巴細胞獲得了高親和力識別腫瘤表面特異性抗原的能力，所以CAR-T細胞產品必須明確具備這種靶向腫瘤細胞的能力。我們可以通過體外實驗，檢測CAR-T細胞對表達靶向抗原的腫瘤細胞系的殺傷作用，來判斷其靶向性能。此外，我們還可以在患者體內通過流式細胞術檢測腫瘤組織中CAR-T細胞的浸潤情況，看其是否能高效進入腫瘤部位發揮殺傷功能【3】，理想的CAR-T細胞應高度富集于腫瘤處。
Fig3：CAR-T細胞阻抗檢測
4 CAR-T細胞的細胞毒活性
CAR-T細胞識別腫瘤并激活后，會釋放各種細胞因子和細胞毒顆粒來攻擊和殺傷腫瘤細胞。所以我們可以檢測CAR-T細胞釋放的IFN-γ、腫瘤壞死因子-α、穿孔素、顆粒酶等水平，來評價其毒殺腫瘤的細胞毒活性以及活化狀態【4】。體外我們可以通過共培養CAR-T細胞和靶腫瘤細胞,檢測上述細胞因子和毒素的含量。脫顆粒實驗也可以直觀反映CAR-T細胞釋放穿孔素和顆粒酶的水平，這些都是評價CAR-T細胞產品殺傷活性的重要指標。
Fig4：CAR-T細胞擊殺靶細胞能力檢測
5 CAR-T細胞的記憶能力
理想的CAR-T細胞還應具有記憶功能，也就是重復激活后能夠取得更強的活性，更快地響應腫瘤信號【5】。我們可以在體外通過多次刺激CAR-T細胞，檢測其產生記憶效應，如細胞因子釋放水平提高，殺傷活性增強。這種獲得記憶能力的CAR-T細胞輸注體內后，可實現對腫瘤更持久更強勁的殺傷作用。
Fig5：CAR-T細胞長久持久性檢測
6 CAR-T細胞治療的安全性評價
CAR-T細胞治療的主要風險在于可能引發嚴重的細胞因子釋放綜合征。所以我們需要檢測CAR-T細胞產生的與CRS相關的細胞因子如IL-6、IL-10和IFN-γ的水平，評估CAR-T細胞治療可能引起CRS的風險。此外還需要監測其它可能的毒副反應【6】。
Fig6：CAR-T細胞治療B-NHL的CRS分級
這些指標可以全方位反映CAR-T細胞的關鍵性能，包括增殖能力、腫瘤靶向性、細胞毒活性、持久性和安全性等。只有同時滿足上述指標要求的CAR-T細胞產品，才可能在臨床中發揮出真正的抗腫瘤療效。因此，開發高活性高質量的CAR-T細胞產品，必須建立科學合理的質量評價體系，掃除在發展即用型產品道路上的障礙，才能在未來實現降低成本和提高治療效果的長遠目標，惠及更多亟需治療的患者。
明星產品推薦
CAR-T療法作為時下最熱門的明星療法，緊隨國內第三款CAR-T產品獲批上市，相關CAR-T企業和平臺紛紛加速研發步伐，積極著眼于差異化布局。未來相關企業除競逐產品安全性能，降本增效將勢在必行，國產替代也將成為產業發展的主要途徑。免疫磁珠作為CAR-T細胞制備的重要物料，在T細胞分選/激活環節扮演著相當重要的角色。同立海源生物GMP級產品ActSep® CD3/CD28分選激活磁珠（貨號：GMP-TL603）集分選和激活功能于一體，高效實現T細胞的分選、激活和擴增，適合于人T細胞、CAR-T等多種T細胞培養技術的應用，并且該產品已完成美國FDA的DMF II型備案（備案號：038124），支持細胞藥物注冊申報。
T細胞耗竭水平
不同的磁珠添加比例下，T細胞激活培養14天后檢測LAG3和PD1的表達水平， ActSep®與競品基本持平，3：1的磁珠與細胞比例下，ActSep®耗竭指標表達更低。此外，在Day 5去除磁珠，將進一步降低T細胞的耗竭水平。
T細胞亞型分析
參考文獻：
【1】 Levine BL, Miskin J, Wonnacott K, Keir C. Global Manufacturing of CAR T Cell Therapy. Mol Ther Methods Clin Dev. 2016 Dec 31;4:92-101.
【2】 Biasco L, Izotova N, Rivat C, Ghorashian S, Richardson R, Guvenel A, Hough R, Wynn R, Popova B, Lopes A, Pule M, Thrasher AJ, Amrolia PJ. Clonal expansion of T memory stem cells determines early anti-leukemic responses and long-term CAR T cell persistence in patients. Nat Cancer. 2021 Jun;2(6):629-642.
【3】 Watanabe Y, Tsukahara T, Murata K, Hamada S, Kubo T, Kanaseki T, Hirohashi Y, Emori M, Teramoto A, Nakatsugawa M, Yamashita T, Torigoe T. Development of CAR-T cells specifically targeting cancer stem cell antigen DNAJB8 against solid tumours. Br J Cancer. 2023 Mar;128(5):886-895. doi: 10.1038/s41416-022-02100-1. Epub 2022 Dec 16. PMID: 36526673; PMCID: PMC9977765.
【4】 Hu Q, Li H, Archibong E, Chen Q, Ruan H, Ahn S, Dukhovlinova E, Kang Y, Wen D, Dotti G, Gu Z. Inhibition of post-surgery tumour recurrence via a hydrogel releasing CAR-T cells and anti-PDL1-conjugated platelets. Nat Biomed Eng. 2021 Sep;5(9):1038-1047.
【5】 Goodman DB, Azimi CS, Kearns K, Talbot A, Garakani K, Garcia J, Patel N, Hwang B, Lee D, Park E, Vykunta VS, Shy BR, Ye CJ, Eyquem J, Marson A, Bluestone JA, Roybal KT. Pooled screening of CAR T cells identifies diverse immune signaling domains for next-generation immunotherapies. Sci Transl Med. 2022 Nov 9;14(670):eabm1463.
【6】 《CD19 CAR-T治療B-NHL毒副作用臨床管理中國專家共識（2022）》
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