Ross Granville Harrison成功地在體外培養出動物組織，并在他的文章中介紹了組織培養的主要原理，描述了培養神經細胞和監測纖維發育的方法（1）。由于目前可用的條件、技術和培養基多種多樣，我們幾乎可以在體外培養和操作每一種細胞。從“經典”細胞生物學方法到基因工程，從生產重組蛋白、抗體和疫苗到癌癥研究，細胞培養因其多種應用而成為一種基礎工具。
 

當然，這些技術的發展是與操作模型和研究其反應所需工具的引入同步進行的。特別是在治療領域，分析細胞活力、毒性和死亡機制的可能性是確定潛在治療方法的關鍵因素。根據細胞類型、首選的檢測方法、特定的實驗條件和確切的目標，可以研究不同的參數。

細胞活力檢測

這些測試可用于評估最合適的細胞培養條件或分析特定處理/程序對培養細胞健康的影響。它們可以基于反映存活細胞數量的不同因素進行評估。由于讀出的是活細胞數，一些檢測方法可用于細胞增殖分析。以下將簡要介紹用于細胞活力研究的最典型指標。
 

代謝活性。這可能是了解細胞是否存活和狀態是否良好的最直觀參數。它可以從不同角度進行研究。
 

線粒體是真核細胞新陳代謝的核心。它們是細胞呼吸的總部，通過一系列復雜的酶促反應最終產生ATP，同時將O2分子還原為H2O。線粒體活性與細胞活力密切相關，因此耗氧率（oxygen consumption rate, OCR）是新陳代謝活躍的良好指標：不健康的細胞往往線粒體功能失調，因此耗氧率較低。最易獲得的OCR評估策略之一是使用磷光水溶性氧探針，通過改變其發射強度來響應溶解氧濃度的變化（2）。更具體地說，一些熒光團的熒光被分子氧淬滅：氧氣濃度越低，檢測到的信號越高。在這些檢測中，通常使用一滴礦物油來密封每個樣品，以避免大氣中氧氣的反向擴散（2，3）。該系統的優點是可直接提供細胞代謝率和線粒體活性的信息，并可直接用于高通量篩選分析。然而，它對培養條件（如溫度和細胞密度）的相對微小變化極為敏感，必須嚴格控制以獲得可重復的結果。
 

通過線粒體活性評估細胞活力的另一種方法是量化培養物中的ATP，因為ATP水平與活細胞數量相關。這通常通過測量ATP在熒光素酶催化下與熒光素反應釋放的生物熒光來實現（圖1）。

圖1 熒光素酶利用ATP氧化氧熒光素中的熒光素，從而產生光。

一組經典的細胞活力檢測方法，同樣與只在活細胞中起作用的酶有關，是基于細胞脫氫酶還原四氮唑鹽（如MTT、XTT、WST-1、WST-8）。反應將形成彩色的甲臢產物，可用分光光度法定量。有色產物的強度與培養物中活細胞的數量成正比。
 

MTT四氮唑還原測定是第一個為96孔板開發的均相細胞活力測定（4），目前仍在廣泛使用。然而，該方法在讀取吸光度之前需要一個額外的步驟來溶解甲臢，而且MTT本身對細胞也有毒性。WST-8還原產生一種水溶性的甲臢產物，無需溶解步驟。此外，它比其他四氮唑鹽更靈敏（圖2），且毒性更低。檢測完成后，相同的細胞可用于其他細胞增殖檢測。

圖2 使用WST-8（CCK-8）和其他四氮唑鹽進行細胞增殖試驗（貼壁和懸浮細胞模型）。

此外，在這種情況下，試劑盒通常不僅用于評估細胞活力，還用于細胞增殖研究。例如，在最近的幾篇研究文章中，該試劑盒被用于測量接種在新生物材料上細胞的增殖情況，這在再生醫學中具有潛在的應用價值（6，7）。
 

膜滲透性：染料包被/排斥。細胞膜（如質膜、核膜等）在細胞生物學中起著重要作用。它們的完整性對細胞的正常功能不可或缺，是監測細胞活力的良好標志。
 

包合染料可在細胞內被動擴散，一旦被某些細胞酶家族裂解，就會被 “卡住”。一個典型的例子是鈣黃綠素引入乙酰甲氧基甲酯（AM）：一旦進入細胞，酯酶就會裂解AM基團，此時親水性更強的鈣黃綠素就無法通過質膜，從而被困在細胞內。失去AM基團還可使鈣黃綠素與細胞內的鈣結合，從而容易發出熒光。由于死細胞缺乏酯酶，因此只有活細胞才會發出熒光。
 

排斥染料是一種熒光分子，只有當細胞質膜不完整時，即當細胞死亡時，才能進入細胞并在細胞內積聚。這類分子的典型例子是兩種DNA插層染料： 碘化丙啶（PI）和7-氨基放線菌素D（7-AAD）。排斥染料可與其它熒光探針結合使用，以獲得有關細胞狀態的更詳細信息，或對死亡機制進行更精細的分析。
 

最后，處于早期凋亡階段的細胞保持其膜的完整性，不會被排斥染料染色。因此，這些染料可與細胞凋亡特異性標記物（即與熒光團連接的Annexin V）結合使用，以區分活細胞（未標記）、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞。相關內容請查閱“檢測細胞凋亡關鍵特征的七大法寶”。

細胞毒性檢測

細胞毒性測定代表了細胞活性的另一面，因為它們側重于檢測和量化特定條件下的細胞損傷，它們的工作原理通常與細胞膜損傷有關。
 

線粒體活動：如前所述，線粒體利用膜電位梯度產生的能量產生ATP。線粒體膜電位（MMP）的喪失與線粒體通透性轉換孔的打開有關，導致細胞色素C釋放到細胞質中，引發其他下游事件，最終導致細胞凋亡。MMP崩解檢測是檢測細胞毒性事件早期階段的關鍵。Rhod123、DiOC6和JC-1等幾種親脂性熒光陽離子染料可用于這種情況。作為帶正電荷的分子，這些染料會根據膜電位在線粒體內積聚：健康的超極化線粒體（基質帶負電荷較多）會積聚較多的陽離子染料，而去極化線粒體（基質有害性較�。﹦t積聚較少的染料（8）。因此，特定處理的細胞毒性效應可通過陽離子染料相關熒光強度的降低來測量。這就是Enzo的MITO-ID® Membrane potential cytotoxicity kit（ENZ-51019-KP002，EnzoLife）工作原理，該試劑盒含有雙發射染料。MITO-ID®探針在功能線粒體中聚集成橙色熒光聚集體，在細胞質中聚集成綠色熒光單體。當線粒體功能日益受損時，橙色熒光會下降。該試劑盒可進行實時MMP檢測，其靈敏度優于同類染料（如比JC-1高10倍，圖3）。
 

圖3 使用MITO-ID®染料（紅色）或JC-1（藍色）評估經CCCP處理的HeLa細胞中的MMP。MMP隨CCCP濃度的增加而降低，如橙色熒光的降低所示。改進的染料水溶性和免洗方案最大程度地減少了變異性，從而獲得了比使用JC-1更高的Z因子（> 0.9）。
 

酶泄漏檢測：由于細胞死亡導致質膜完整性喪失，通常被限制在細胞內的酶不可逆轉地泄漏到細胞外空間。因此，檢測這些“逃逸”酶的活性是細胞毒性的一個明顯標志。在這種情況下，檢測乳酸脫氫酶活性（LDH）是最流行的解決方案之一。LDH是一種穩定的細胞質酶，在所有參與糖酵解過程的細胞中均有表達。由于細胞凋亡、壞死或其他形式的細胞損傷導致細胞膜完整性喪失，LDH被釋放到細胞培養基中（10）。
 

在典型的檢測過程中，LDH催化乳酸轉化為丙酮酸，將NAD+還原為NADH。后者反過來將四氮唑鹽還原成水溶性的甲臢染料，甲臢染料的量與LDH的總活性成正比，從而與受損細胞的數量成正比（10）。與CCK-8試劑盒類似，Enzo的LDH Cytotoxicity WST assay（ENZ-KIT157，EnzoLife）使用水溶性四氮唑鹽（WST）作為底物（圖4）。

圖4 LDH相關細胞毒性測量原理。

這兩種試劑盒可視為兩種互補的檢測方法，它們的組合可在給定的實驗條件下對細胞健康狀況進行全面評估（圖5）。

圖5 Cell Counting Kit-8（ALX-850-039，EnzoLife）和LDH Cytotoxicity WST Assay（ENZ-KIT157，EnzoLife）提供了補充信息。

說到細胞毒性檢測，藥物誘導毒性篩選是我們能想到的最直接的例子，盡管這只是潛在應用之一。例如，幾個月前，韓國的一個研究小組使用LDH Cytotoxicity WST（ENZ-KIT15，EnzoLife）檢測幽門螺旋桿菌感染后THP-1細胞的細胞毒性，研究重點是查爾酮衍生物對NLRP3炎性體激活的保護作用（11）。