支原體檢測試劑盒說明書(QPCR法）
【產品規格】
BPM50 50 次/盒
【產品說明】
支原體(mycoplasma)：目前發現的最小的原核生物，據統計約 15~35% 的細胞被支原體污染。支原體污染會改變宿主細胞的結構與功能，易致實驗結果不穩定，須對培養細胞定期進行支原體檢測。
本產品試劑盒采用雙色熒光 qPCR (TaqMan 探針法)檢測支原體DNA，檢測對象為細胞培養的上清液或細胞本身。該試劑盒具有以下特點：
靈敏：配合高效 DNA 提取試劑盒，檢測靈敏度達 10cfu/mL。
穩定：全程閉管操作，無交叉污染。
可靠：含內參基因，避免假陰性。
方便：操作簡單，無需電泳步驟。
定量：以 CT 值判斷，可定量檢測。
【運輸及保存條件】
低溫冷凍運輸， -20℃保存，有效期 1 年。
【產品組分】
組分名稱 BPM50
Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 900µL
Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 900µL
Mycoplasma Positive Control 100µL
RNase Free Water 100µL
注：Positive Control 濃度為 2×10 3拷貝/µL。本試劑盒提供試劑，使用前先低速離心后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。
【操作步驟】
1. 樣本制備（自備）
A 樣本的標準制備方案：請使用高效DNA 提取試劑盒取樣本 DNA。推薦使用無微生物污染級別的核酸提取試劑盒。低溫保存的血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養液等生物制品，即使存在支原體污染，一般支原體含量也較少，建議提取樣本DNA 后檢測。
B 樣本的簡易快速制備方案：可用于細胞培養上清、細胞懸液、血液，樣本制備步驟如下。
（1） 細胞培養上清：取 1~1.5mL 細胞培養上清；
（2） 細胞懸液：直接取 2µL 細胞懸液作為模板進行qPCR 反應。要求樣本內細胞總數量不超過 10000 個，樣本可用細胞培養基稀釋400 rpm 離心 3 分鐘；取 2µL 上清作為模板進行qPCR反應。
（3） 血液：直接取血液樣本作為模板進行 qPCR 反應。注意血液中的細胞對PCR反應有較強抑制作用，內參檢測通道會顯示異常。根據不同應用場景，有兩個建議：①中間質控環節，對靈敏度要求中等，無需達到10cfu/mL，可用無菌水稀釋 10 倍，充分混勻后，取 2µL作為模板進行 qPCR 反應。②放行檢測，要求靈敏度達到10cfu/mL，建議提取樣本DNA 后檢測。
2. qPCR 反應體系及條件
反應體系以20µL為例：
PCR 儀設置以 ABI 7500 為例，相對定量模式，選擇
TaqMan 探針法：
【閾值設置】
以ABI 7500 為例，擴增曲線選擇 log 法，基線設置3~15 個循環。建議用 log 法擴增曲線保證結果穩定可靠。
（1）內參(HEX/VIC)閾值設定：以陰性對照定內參擴增曲線閾值，將內參的CT 值定為 27±2。
（2）支原體(FAM)閾值設定：以陽性對照定支原體擴增曲線閾值，將支原體(FAM)的CT值定為 26±3。
說明：
如果陽性對照管的支原體(FAM)CT 值>30，但陽性對照管及陰性對照管的內參(HEX)CT 值正常，表明陽性支原體對照模板有降解。
如果陰性對照管的內參(HEX/VIC)CT值>30，陽性對照管的內參(HEX)CT值>30 且支原體(FAM)CT值>30，表明 Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 試劑成分已失效。
【結果判讀】
根據支原體(FAM) CT 值判定是否發生支原體污染，具體標準如下：
注：檢測結果落在灰區或與其他方法檢測結果矛盾時：
1. 檢查內參通道擴增是否正常，擴增曲線是否選擇log 法。
2. 內參擴增不正常，表明 PCR 反應未正常進行，PCR 體系受到干擾，需重復檢測
3. 內參擴增正常，結合 CT值和擴增曲線形態判斷。
4. 無典型擴增曲線，可認為該樣本為支原體陰性。
5. 有典型擴增曲線，需重復檢測。重復結果不一致判為陰性；結果一致，判為弱陽性。
【注意事項】
由于 PCR 反應非常靈敏，實驗操作中應注意以下事項，以免發生DNA 污染：
1. 建議陽性對照與待測樣本、陰性對照在實驗室的不同區域進行添加，在 qPCR 反應板上陽性對照的排布應遠離待測樣本和陰性對照。
2. 建議使用不同的移液器添加陽性對照與待測樣本、陰性對照，并使用帶濾芯的槍頭進行加樣。
3. 試劑盒開啟后，陽性對照應與試劑 Mix、陰性對照分開存放。
4. qPCR 封膜時須反復壓緊。
5. 實驗室環境須定期清除支原體
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