論文發表 | SARS-CoV-2受體結合域放射探針：一種非侵入性的血管緊張素轉換酶2在小鼠體內的定位方法

文獻信息

北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所，核醫學科，國家藥監局放射性藥物研究與評價重點實驗室，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，楊志主任團隊的研究成果SARS-CoV-2 receptor binding domain radio-probe: a non-invasive approach for angiotensin-converting enzyme 2 mapping in mice（SARS-CoV-2受體結合域放射探針:一種非侵入性的小鼠血管緊張素轉換酶2定位方法）在國際著名學術期刊Acta Pharmacologica Sinica（影響因子6.150）發表。平生公司的Super Nova^® PET/CT 產品在論文中提供了重要的小鼠肺部PET/CT圖像和定量分析。

該研究的通訊作者為核醫學科楊志研究員和朱華研究員。第一作者為李丹和丁縉同學。

文獻背景：

2019年底爆發的冠狀病毒病2019 (COVID-19)導致由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)引發的全球大流行。到目前為止(2021年10月)，它已成為全球一場嚴重的公共衛生危機。自該疾病傳播以來，瑞德西韋等幾種實驗性抗病毒藥物已逐步進入臨床試驗階段，但死亡人數仍大幅上升。2021年6月12日，美國媒體報道了埃默里大學醫學院放射腫瘤學對COVID-19重癥患者進行的首個低劑量治療的效果。威爾士和來自博蒙特健康中心、俄亥俄州立大學、邁阿密浸信會健康中心和巴羅神經學研究所的同事們已經發表了一篇關于這種方法背后的基礎科學的文章。結果表明，低劑量輻射可以減輕炎癥，促進COVID-19的愈合。除疫苗外，中和抗體和小分子抗病毒藥物是有望降低COVID-19嚴重程度和致死率的干預工具，但目前仍沒有令人滿意的產品。

SARS-CoV-2感染機體的機制復雜，包括病毒與宿主細胞之間不同分子途徑之間的許多相互作用。血管緊張素轉換酶2 (Angiotensinconversion enzyme 2, ACE2)是羧肽酶ACE的同源物，是腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system, RAS)的主要活性肽。Zhao等發現，SARS-CoV-2通過S-蛋白與人ACE2相互作用感染人呼吸道上皮細胞。隨后，Markus Hoffmann等人在BioRxiv上發表了相關研究，發現SARS- CovV-2與SARS冠狀病毒通過相同的ACE2受體感染，并利用SARS-CoV-2所使用的細胞蛋白酶TMPRSS2。ACE2是SARS-CoV-2入侵細胞的唯一入口，因此盡早開發靶向和抑制病毒進入的臨床藥物尤為重要。

SARS-CoV-2的刺突蛋白與人呼吸道上皮細胞的血管緊張素轉換酶2 (angiotensin-轉換酶2,ACE2)相互作用，導致感染。此外，研究發現，低劑量輻射可以減少炎癥，有助于治愈COVID-19。受體結合域(receptor binding domain, RBD)是人體內羧基端帶有組氨酸標簽的重組刺突蛋白，與ACE2結合。因此，我們構建了放射性碘化RBD作為分子靶向探針，在體內無創探測ACE2的表達，并研究抑制ACE2的放射治療途徑。

用N -溴代丁二酰亞胺(NBS)介導的方法用[¹²⁴I]NaI標記RBD，純化后得到¹²⁴I-RBD，比活性為28.9 GBq/nmol。在鹽水中5天放射化學純度(RCP)在90%以上。¹²⁴I-RBD與hACE2結合的解離常數為75.7 nM。HeLaACE+細胞對¹²⁴I-RBD的攝取在2 h時為2.96%±0.35%，過量RBD可明顯阻斷細胞對¹²⁴I-RBD的攝取，并降低至1.71%±0.23%。

BALB/c小鼠靜脈注射后¹²⁴I-RBD的生物分布呈中等代謝率，注射后24 h (p.i.)的器官分布與體內表達譜相似。Micro-PET成像小鼠肺內注射顯示高攝取肺在1,4,24小時p.i.. 總之，實驗結果證明了¹²⁴I-RBD作為新冠病毒靶向分子探針的潛力。該探針可用于哺乳動物的非侵入性ACE2繪圖。

實驗方法：

動物研究

正常KM小鼠或HepG2ACE2+模型裸鼠經尾靜脈注射3.7 MBq的¹²⁴I-RBD。然后分別在注射后0.5、2、24和60 h (p.i.)的每個時間點進行10分鐘的靜態PET掃描。使用小動物PET/CT掃描儀(Super Nova PET/CT，中國平生醫療科技（昆山）有限公司)，通過Avatar 3D重建PET圖像，通過繪制這些器官的ROI計算出ROI衍生的標準攝取值(SUV)。

正常KM小鼠通過氣管內和肺內注射0.74 MBq¹²⁴I-RBD和游離的 ¹²⁴I]NaI，然后在1,4,24和48h p.i進行PET/CT成像。小鼠腹腔注射0.2 mL 4%水合氯醛麻醉，放置在一個板上，用一根繩子固定在它們的上頜牙齒上。用冷光照亮老鼠的脖子，以顯示氣管的入口。然后用鑷子把舌頭拔出來，用壓舌器壓住舌根。很容易看到會厭為一個開閉的亮點。這是氣管的入口。將小鼠氣管導管插入氣管，用注射器緩慢推入0.05-0.1 mL藥物。拔出導管后，小鼠在被放入籠子前再懸浮10分鐘。

實驗結果：

圖3 ¹²⁴I-RBD的Micro-PET成像。對正常小鼠尾靜脈注射后0.5、2、24、60 h的¹²⁴I-RBD進行Micro-PET/CT成像。b不同時間點重要器官的SUV值。c ¹²⁴I-RBD在正常小鼠體內的生物分布。

圖4 肺內注射¹²⁴I-RBD的Micro-PET顯像。肺內注射后1、4、24、48 h正常小鼠¹²⁴I-RBD的Micro-PET/CT成像結果。b正常小鼠肺內注射后0.5、1、4、24、48 h [¹²⁴I]NaI的Micro-PET/CT成像結果。c不同時間點重要器官¹²⁴I-RBD的SUV值。d重要器官[124I]NaI在不同時間點的SUV值。

圖5 Micro-pet成像分析。a肺內注射¹²⁴I-RBD和對照[¹²⁴I]NaI后4小時和24小時肺部攝取的切片圖像。①、②、③分別代表小鼠的甲狀腺、肺和胃。b ¹²⁴I-RBD在肺、胃、甲狀腺、腎、肝、肌肉等器官及對照[¹²⁴I]NaI不同時間點的SUV變化。c ¹²⁴I-RBD與對照[¹²⁴I]NaI不同時間點肺SUV /腎、甲狀腺比值。d SUV的124I-RBD和控制[¹²⁴I]NaI在重要器官的時間。小鼠注射¹²⁴I-RBD后1、4、24、48 h進行小動物PET/CT成像，[¹²⁴I]NaI使成像時間延長0.5 h。免疫組化小鼠肺組織顯示肺中ACE2表達。

圖6腫瘤模型Micro-PET顯像。在注射后0.5(2.2/1.1)、1(2.2/1.1)、4(1.2/0.6)、24(0.36/0.18)和48 h(0.36/0.18)，對表達ACE2的HepG2荷瘤小鼠的¹²⁴I-RBD進行Micro-PET/CT成像。b HepG2荷瘤小鼠注射后0.5(2.2/1.1)、2(2.2/1.1)、4(1.2/0.6)、24(0.36/0.18)和48 h(0.36/0.18)時的¹²⁴I-RBD Micro-PET/CT成像。c每次注射后Micro-PET成像SUVmean比較。兩組均取心、肝、肺、腎、胃、腸、肌肉和腫瘤(n= 3)。窗寬和水平按時間點不同，時間點后列于括號內。

結論：

在此，研究者們首次成功構建了¹²⁴I-RBD，作為新型的COVID-19分子靶向探針。通過放射標記RBD探測ACE2的表達可用于無創的ACE2繪圖。結合現有文獻，提示碘同位素修飾RBD對人ACE2進行靶向監測是可行的，為放射治療提供了臨床前經驗。

使用設備：

 Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外觀圖）